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中药半夏的药理及其蛋白分离纯化研究
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作为一种药用价值很高的中药药材，半夏具有燥湿化痰、降逆止呕、生用消疖肿等作用。随着半夏蛋白的深入研究，获得大量满足研究要求的半夏蛋白就变的十分重要。蛋白分离公司提供的蛋白质分离纯化服务是用生物工程下游技术从混合物之当中分离纯化出所需要得目的蛋白质的方法，可用于进行半夏蛋白分离和蛋白纯化，以获得高质量的半夏蛋白进行医学研究。 蛋白分离公司的提供的蛋白分离纯化服务的总目标是增加制品的纯度或比活，具体步骤包括把蛋白质从原来组织或细胞中以溶解的状态释放出来，并保持原来的天然状态，不丢失生物活性的前处理和将所要的蛋白质与其他杂蛋白分离开来的粗分级处理、样本进一步纯化的细分级分离和最后的结晶。蛋白分离服务毫无疑问地包含在了一些蛋白分离公司提供的服务中。 美迪西提供蛋白分离服务，其在重组蛋白表达与纯化服务方面有10余年经验积累，美迪西生物医药拥有多种蛋白表达系统，包括原核蛋白表达系统、酵母蛋白表达系统、昆虫细胞蛋白表达系统（杆状病毒）哺乳动物细胞蛋白表达系统，具备多种融合技术，可以为你在蛋白表达与纯化方面提供多种选择。 半夏含有多种活性成分,如活性多糖、生物碱、甾醇和半夏蛋白等。近年来研究发现,半夏蛋白是半夏抗肿瘤、抗生育和抗虫作用的主要有效成分。 1、半夏的药理作用 （1）镇咳祛痰 半夏中生物碱能抑制咳嗽中枢产生镇咳作用。生半夏、姜半夏和法半夏的煎剂静脉注射，对猫碘液注入胸腔或电刺激喉上神经所致的咳嗽均具有明显的镇咳作用，0.6g/kg 的镇咳作用接近可待因1mg/kg。 大鼠腹腔注射半夏水煎剂可明显抑制毛果芸香碱对唾液的分泌作用。以生半夏和清半夏的乙醇提取物给小鼠灌胃，用酚红法测得清半夏的乙醇提取物有一定的祛痰作用，而生半夏未见明显作用。研究表明半夏贮存时间越长，祛痰作用越强。 （2）镇吐催吐 制半夏能激活迷走神经传出活动而具有镇吐作用，生半夏则能“戟人喉”、“令人吐”。半夏能延长硫酸铜致犬呕吐的潜伏期或不发生呕吐，能拮抗皮下注射盐酸去水吗啡犬的呕吐，此作用不受川乌的影响。 （3）抗溃疡作用 半夏水煎醇沉液能减少胃液分泌，降低胃液游离酸度和总酸度，抑制胃蛋白酶活性，保护胃黏膜，促进胃黏膜的修复，具有抗大鼠幽门结扎性溃疡、消炎痛性溃疡及应激性溃疡的作用。 (4)促进胆汁分泌 半夏能促进家兔胆汁分泌，能使小鼠血中皮质酮上升，增强皮质酮对肝脏内络氨酸转氨酶的诱导作用，升高肝脏内络氨酸转氨酶的活性。 （5）抗心律失常作用 给犬静脉注射半夏浸剂，可使氯化钡所致的室性早搏迅速消失且不复发，有效率为97%。可使肾上腺素所致的室性心动过速迅速转为窦性节律，有效率为96%。 （6）抗凝作用 半夏具有较明显降低甘油三酯和低密度脂蛋白的作用，能够降低全血黏度、抑制红细胞的聚集和提高红细胞的变形能力。半夏蛋白是已知的唯一只与甘露醇而不与葡萄糖结合的一种具有凝集素作用的蛋白质，与兔红细胞有专一的血凝活力。此外，半夏蛋白对羊、狗、猫、豚鼠、大鼠、小鼠和鸽子的红细胞也有凝集作用，但对人、猴、猪、鸡、鸭、蟾蜍等的红细胞无凝集作用。提示：半夏蛋白的细胞凝集作用不仅具有动物种属专一性并存在细胞类别专一性。 （7）抗肿瘤作用 在临床上有半夏对治疗食道癌、胃癌、舌癌、皮肤癌和恶性淋巴癌取得较好疗效的报道。半夏提取物对HeLa 细胞、小白鼠实验肿瘤180、HCA实体瘤(肝癌)、U14(鳞状上皮型子宫颈癌移植于小白鼠者)均有一定的抑制作用。半夏总生物碱对慢性髓性白血病细胞(K562)有抑制作用，能损伤悬浮生长的K562细胞形态，抑制其增殖。半夏中提取的多糖具有较强的网状内皮系统激活活性，能增强网状内皮系统吞噬功能和分泌作用，抑制肿瘤的发生和增殖。 甲醇提取的半夏多糖组分具有多形核白细胞诱导能力，由此推测，半夏可能是通过活化多形核白细胞，导致肿瘤破坏的细胞反应。 此外半夏还具有抗早孕、镇静催眠、抑制腺体分泌和对胰蛋白酶具有抑制作用等作用。然而半夏天然药物中的有效成分通常十分复杂,而半夏中所含蛋白质就不少于10种。目前报道的半夏蛋白纯化方法主要包括疏水色谱、亲和色谱和离子交换色谱等，但都存在一些缺陷，而不能满足进一步研究的要求，因此进行蛋白分离和蛋白纯化研究很重要。 2、半夏蛋白的分离和纯化研究 有研究者在常规的半夏蛋白纯化的基础上，先尝试利用凝胶过滤从0.45硫酸铵饱和度盐析提取的半夏总蛋白中分离得到一种纯度仅为80%相对分子量约12KDa的半夏蛋白；又尝试了Sephadex G-50和MBP Trap HP亲和柱组合分离，从0.45～0.8硫酸铵饱和度盐析提取的半夏总蛋白中先后分离得到两种半夏蛋白，相对分子量分别约为22KDa和40KDa，纯度约90%；但两种方法重复性均极低，不利于后续研究。 而后，选用了疏水层析直接对0.45硫酸铵饱和度盐析提取的半夏总蛋白进行分离纯化，也得到一种相对分子量约为12KDa的半夏蛋白，虽然重复性提高，纯度可达90%，但该方法对操作条件要求极高而不利于大量提纯。 最后研究者根据半夏凝集素对甘露糖具有专一亲和的性质，以甘露糖为亲和配基，环氧活化琼脂糖凝胶为介质，制备了一种甘露糖-Sepharose4B凝胶，并从0.95硫酸铵饱和度盐析提取蛋白中分离得到纯度在95%以上的一种半夏凝集素，其相对分子量为12.165KDa，且重复性高，操作方便，可以大量分离以满足后续试验。 研究还发现该方法受到半夏凝集素与甘露糖配基两者之间疏水性的直接影响。后续研究表明该半夏凝集素为一种糖蛋白，能使小白鼠血红细胞产生凝集反应，最低反应浓度为25μg/ml，而≤12.5μg/ml时小白鼠血红细胞未见明显凝集反应；对该半夏凝集素进行的氨基酸组成分析表明该凝集素中含有15种氨基酸，其中天冬氨酸含量最高，半胱氨酸含量最低，与一般植物凝集素相符。 后来研究者还对半夏凝集素的原核表达及纯化做了研究，主要内容是利用含半夏凝集素(PTA)基因的表达载体pET-28a(+)转化大肠杆菌BL21(DE3)，鉴定转化成功后，IPTG诱导表达培养，经SDS-PAGE分析，存在与预期相符的表达蛋白，相对分子量约为30KDa，且该蛋白为不溶性的包涵体。超声波裂解菌体分离包涵体，利用表达蛋白中的组氨酸标签进行Ni柱亲和纯化，筛选最优条件，获得大量半夏凝集素。 通过对半夏蛋白的药理及其分离提纯研究，为半夏蛋白的进一步研究提供了基础。 |
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