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浅析RNA干扰技术在基因敲除上的应用
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基因敲除是一项重要的分子生物学技术，新技术如CRISPR/Cas9基因编辑技术的运用可显著降低基因敲除价格和提高成功率。基因敲除可利用微生物体内的同源重组系统，在一定选择压力下使体外改造的某功能基因与受体细胞染色体上的功能基因之间发生同源重组，从而改变细胞的遗传特性。RNA干扰（RNA interference,RNAi），又称转录后基因沉默，是指将特异性同源双链RNA导入到细胞内，使目的基因的不表达或表达水平下降。与传统的基因敲除技术相比，RNAi技术具有投入少、周期短、操作简单等优势。 一般来说基因敲除价格较高，根据市场标价，实验小白鼠每只1.5元，呆萌的小仓鼠9.9元包邮，啮齿目的亲戚、圆滚滚的可爱龙猫也不超过千元。但是，基因敲除小鼠打了七折后还要将近几万元。 利用基因敲除技术可以阻断细胞的代谢旁路，或通过引入突变位点改变目的产物的产量或质量，从而达到微生物育种的目的。在中国cro公司排名中靠前的美迪西在分子生物学、细胞生物学、体外生物学、结构生物学等生物学领域具有丰富广泛的经验，通过酶水平、细胞水平测定等技术平台帮助客户进行化合物筛选及化合物特性、作用机制及生物标记物分析等研究，保证了客户项目的有力实施，帮助客户推进药物研发的进程。 1、基因敲除研究的作用 生命体由无数块蛋白质拼图组成，为了确认某种蛋白质在生命现象中发挥的作用，最直接的办法就是像拆电视一样，把其中一个零件拆下来，看看电视有什么反应。随着科学进步，研究人员开发出了人为制造变异体的方法，人为破坏基因并分析其后果，这就是所谓的“基因敲除实验”。以分子生物学的生命观看来，生命体是由无数微小的零部件组装成的精密模型，是一部“分子机器”，“基因敲除实验”是让分子机器某个零件停止工作，仔细观察生命体在这种状态下会产生怎样的异常，进而分析该零件有何种作用。 在后基因组时代，大量未知基因的功能的研究显得尤其迫切，由于基因组作为生命体的基本蓝图，它的完整功能只有在完整的生物个体及其整个生命过程中才能得到最完整确切的体现，尤其在高等生物中，细胞间的相互作用以及神经、内分泌、免疫调控网络等对基因的正常生物学功能都具有重要的影响，因此，在生物体内研究基因组的功能将是一个必然的选择。用于小鼠模型构建的转基因技术和基因敲除技术已成为基因研究的重要手段，尤其是条件性基因敲除技术可以在时问和空间上调节基因的表达，从而非常有效的对基因功能进行研究。 但是这项技术存在着操作复杂、费时和昂贵等缺点。RNA干扰技术的出现为解决这个问题指明了方向。现在普遍认为转录后基因沉默是生物保持基因的完整性，抵御外来核酸入侵，抑制转座因子诱导DNA突变的手段，广泛存在于真菌、植物、线虫、脊椎动物和大肠杆菌中。 2、什么是RNA干扰技术 RNA干扰是一种普遍的转录后基因沉默的机制，由siRNA(smallintereferenceRNA)引起，siRNA是外源基因产生的dsRNA在Dicer酶的作用下所产生的长度为21-22nt的一系列片段的总称，具有很强的关闭基因的功能,能够介导RNA干涉现象，诱导出一种由siR2NA分子、核酸酶以及螺旋酶等结合在一起的RNA诱导沉默复合物(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)。RISC能够解开siRNA并精确的指导特异的mRNA降解，使细胞抵抗外来基因侵入及病毒感染。因此，通过将dsRNA分子导入细胞内，特异性地降解细胞内与其同源的mRNA，封闭内源性基因的表达来失活该基因同样可以实现基因的敲除。 1998年,RNAi技术首先在线虫中建立,目前已在线虫、果蝇、真菌及拟南芥等生物中分别建立,并用于研究特定基因或已知基因在特定发育时期的功能。 3、RNA干扰技术的作用特点 RNAi的作用特点有: (1)具有高度的特异性，针对同源基因共有序列的RNAi则只能导致同源基因失活，不影响其他内源性mRNA的表达； (2)效率高，少量的dsRNA分子就可以完全抑制相应基因的表达，能在低于反义核酸几个数量级的浓度下研究目的基因； (3)穿透性强，RNAi抑制基因表达的效应可以穿过细胞界限,在不同细胞间长距离传递和维持。 RNAi技术操作相对简便，结果快捷，尤其对于那些不容易获得突变体的基因或生物体来说，RNAi技术无疑提供了一种快速有效的研究基因功能的方法。由于dsRNA引入生物体内的剂量和时间可以人为控制，RNAi技术可以用于研究某个特定基因在特定发育阶段的功能。伴随着功能基因组学研究的深入，RNAi技术在研究信号传导途径、胚胎发育相关因子以及参与基本生物反应过程的新基因功能方面有巨大发展潜力，它将带来生物学研究的革命。 4、RNA干扰技术的缺点 虽然RNAi技术有如此明显的专一性优点，但RNAi不能作用于所有基因和某些细胞类型(如神经元)，很多设计的dsRNA不能产生抑制靶基因转录后沉默的效果。由于RNAi实际上只是在转录后水平上降低基因的表达，并不象基因敲除那样完全把基因从基因组中剔除掉，有时也会因背景的不干净导致产生的表型难以分析。因此,RNAi不能完全取代传统的基因敲除技术。 随着功能基因组学的兴起和发展，基因敲除技术被人们广泛的用于探讨基因功能的研究，通过基因敲除技术逐渐明确了大量模式生物和重要功能微生物的全基因组，并能准确定位功能基因，从基因水平上更加清楚的认识微生物的代谢规律。同时，敲除载体及相关技术的完善可进一步推动微生物代谢工程的广泛应用，通过基因敲除手段改变微生物细胞的代谢流向，阻断有害代谢产物积累，可望降低成本，大幅度提高生产水平及产品纯度。 |
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