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jifeng3074

铜虫 (小有名气)

[交流] mRNA表达,但是蛋白不表达原因是什么啊?

在研究细胞永生化时,研究的细胞端粒酶没有活性的.
我通过RT-PCR测了mRNA,但是有弱表达,WESTERN BLOT没有蛋白表达,请问可能的原因是什么啊?
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1楼 2009-04-25 15:59:14
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xiaotongxyz

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
jifeng3074(金币+4,VIP+0):谢谢 4-26 17:08
有一种可能是你的抗体特异性不高，Western检测不到，你可以通过换用抗体，或者重复试验检测这一点，首先确定你的抗体没有问题。
另一方面，你可以测一下序，你不是已经获得了CDNA了吗，PCR扩增出你的片断，之后测序，看一下基因是否发生了突变，这样也可能造成无法翻译。
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我不是一个随便的人，我随便起来不是人，哈哈
4楼2009-04-25 19:50:33
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hljbhs

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
jifeng3074(金币+10,VIP+0):谢谢 4-26 17:08
http://www.antpedia.com/viewspace-3348

换菌种，质粒，融合其他蛋白，一个个试吧:-)
http://www.instrument.com.cn/bbs/shtml/20070712/907021/
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小木虫优秀会员
2楼2009-04-25 16:16:30
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jiaminl

铁杆木虫 (知名作家)
★ ★ ★ ★ ★ ★
jifeng3074(金币+6,VIP+0):谢谢 4-26 17:08
看看这个 可能有一些启示

mRNA转录后修饰及蛋白质表达的一些思考
上一篇 / 下一篇  2007-10-10 20:49:57 / 个人分类：综述

查看( 53 ) / 评论( 0 ) / 评分( 0 / 0 )

        蛋白水平的变化很复杂的，包括磷酸化等一系列转录后修饰，都是对其功能的调控，因此其实研究某种基因的改变，仅仅在这两个方面也是非常肤浅的。
蛋白功能的强化不仅可以表现在水平的增加，也可表现在活性的提高（磷酸化等），或者更新率（turnover）的提高。
        虽然说mRNA和蛋白水平是一个相偶联的过程，但是两者没有必然的一致的趋势，因此不一定mRNA水平升高了就一定蛋白浓度就会提高，反之亦然。
        mRNA水平升高代表的是启动子或者增强子的激活，也许是上游转录因子的激活，而蛋白水平的提高则大多数和功能增强相偶联。机体是一个相互协调一致的整体，因此两者的变化往往是相互偶联的，因此验证两者的关系对于确认某个基因的激活是相当有力的。
        免疫组化或者免疫荧光都是反应细胞内某种蛋白定位或者形态学上的一个大致的变化趋势的，并不能确切说明变化的形式，因此我认为如果缺少形态学的证据只要在蛋白水平验证即可，毕竟都是反应蛋白水平的，当然反应细胞内定位的情况就另当别论了。

        除了在一系列的很基础研究中，要进行转基因等定位和mRNA表达检测之外，大多数的以“疗效”为目的的研究都只检测蛋白表达水平应该就能说明问题了。因为无论研究是什么的目的，其结果最终大都应该是落脚到对机体功能的影响，那么这就是蛋白的水平了。试想无论在基因水平有什么样的变化，最后的蛋白水平没有变化，就说明这样的变化是“无效”的。（除外对其他基因的横向影响和联系）有说目前的蛋白检测的技术水平不是很高，可能出现了基因水平的变化，蛋白也可能变化了，只是我们不能检测出。当然这也可能是存在的。但一种因素要发挥作用，应该是与两个方面有关的：一是质；一是量。

        检测蛋白的量的变化，很多是有酶有mRNA的变化的大和明显。某种植物在长期受到某种刺激后，体内某种酶的mRNA上调了几千倍，而酶的量其实没有那么大明显。然后就找到了原因是间接的调控了酶的转录。这是一种很常见的调节方式。

        如前所述，蛋白表达水平改变只是蛋白功能改变的一个侧面反应，
很可能蛋白的功能已经有明显改变了但是表达水平也没有改变。举几个例子：
1. 小分子抑制剂，直接靶向于蛋白的pocket或者说小分子配体与其对应的蛋白质受体结合后，很可能就抑制了蛋白的功能，但是其表达的量很可能就不会变化甚至代偿性升高，难道这就是蛋白功能增强了吗？
2. 体内很多激酶，什么叫激酶？就是将一个蛋白的特定位点磷酸化，使其得到高活性或者失去活性。这是最经典的例子，很多药物也是通过激酶调控蛋白的，而非刺激蛋白表达。这仅仅是体内蛋白调控的冰山一角。此外泛素化、乙酰化很可能可以使蛋白降解或者失活，而还有通过氧化还原机制的蛋白活性调控。
        总之，对于某种基因的调控，主要在两个层次一个是转录水平，一个是转录后（或者说是翻译后）水平，后者并不显著改变蛋白的表达水平，因此也是最快最直接的，在短期的调控大多属于此类，而在慢性或者持续性刺激的情况下出现转录水平的改变的可能性比较大。当然也有反例。
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Nevergiveup!
5楼2009-04-25 22:52:55
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peipeizhan

银虫 (小有名气)
二楼回答的很好…应该可以…
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6楼2009-04-26 07:20:14
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