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大肠杆菌生产的霍乱毒素B亚单位 马清钧; 刘传暄; 熊凌霜; 于秀琴; 军事医学科学院生物工程研究所; 军事医学科学院生物工程研究所 北京; 中国科学B辑, Science in China,Ser.B, 编辑部邮箱 1990年 07期 |
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2楼2009-04-22 10:58:52
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第6卷第1期 1990年2月 生物化学杂志 Chinese Biochem ical Journal Vo1．6．No．1 Feb．， 1 990 工程菌产霍乱肠毒素B亚单位的纯化 熊凌霜马清钩张艳红 (军事医学科学院生钎工程研兜所， 北京) 摘要本实验室使霍乱肠毒素(CT)B亚单位基因在大肠杆菌中获得表达，井 能分泌到胞外。将该菌抹培养物上清经过超滤浓精后，用偶联上霍乱毒素IgG的 CNBr-Sepharose 4B进行表和层析，得到表述产物霍乱毒素B亚单位纯蛋白。经PA— GE、HPLc及琼脂晃疫扩散等方法鉴定证明试蛋白与走然霍乱肠毒素B亚单位完全 相同。 关键词霍乱肠毒素， 蛋白纯化， 亲和屡析 霍乱弧菌和副霍乱弧菌均可产生霍乱致病因子—— 霍乱肠毒素(cT)。霍乱肠毒素是由 A、B两种亚单位以非共价键连接构成ru 。A亚单位是毒寨的毒力部份。B亚单位没有毒 性， 是毒素的抗原活性部分， B亚单位具有与靶细胞膜上受体结合的能力。因此，霍乱毒素 B亚单位可以用于构建预防霍乱的疫苗及作为受体结合机制研究的材料。 天然霍乱肠毒素B亚单位的制备通常是先将霍乱毒素纯化，然后通过解离剂(尿素、胍 盐、甲酸等)作用，使B亚单位与A亚单位分离而获得 “ 。Mekalanass J．J．用阳离子交换 剂磷酸纤维素从霍乱弧菌569B培养物上清中直接分离出B单位 】。 八十年代初， 国外开始采用遗传工程技术， 将霍乱毒素基因克隆，并改造成A—B 。奉实 验室马清钧等人应用遗传工程技术，构建成功该毒素的B亚单位基因克隆，获得了产物分泌 到胞外的高表达菌株 】。现在，我们用免疫亲和层析分离技术已将该工程菌产生的毒素B 亚单位纯化成功，得到了有活性的B亚单征纯化葺百■一～ 一 材料与方法 一 、试剂 CNBr—Sepharose 4B (Phamaeia)， 阴离子交换纤维素DEn (Whatman)， 霍乱毒素粗品 抗血清(药品生物制品鉴定所)，霍乱毒素纯品抗血清(奉实验室制备)， 霍乱毒素CT(Sig— ma)，霍乱毒素B亚单位(Sigma) 菌株——E．eoli(PMM2)：该菌株携带播有CT-B基因的重组质体。 二、方法 1． 菌株培养：E．ooli(PMM2)经LB固体培养基活化后按种于LB液体培养基(含氨苄青 收稿日期；1988·0g一05， 修匮日期I 1989‘91一 维普资讯 http://www.cqvip.com 霉素50~g／mL)做种子液，再特种牛肉膏一蛋白胨培养基(另加入0．1mol／LK HPO。-NaH P0。)， 37~C培养过夜，离心弃菌，收集上清，用琼脂免疫单扩散法测CT-B含量 。 2． 超滤终缩 在超滤器上(SS-1平板搅拌型超滤器，上海瑞丽分析仪器厂)， 用分子 截留量为一万的超滤膜对培养物上清进行超滤浓缩8—9倍，弃下滤液。 3． DE52处理l将DE52用0．01mol／L NaHPOl-Na2H2PO4(pH6．07充分平衡。同时将超滤 浓缩液调至pH6．0，与DE5。纤维素混和， 不时搅动，室温放置I小时后，抽滤收集下滤液备 用。 4． 抗CTIgG的制备：用霍乱肠毒素CT(Sigma)通过臀部肌肉注射免疫家觅，每次50#g毒 素剂量，每隔三十天加强一次，共注射三次， 末次免疫后两周收集血清， 测定效价为l：32 (用免疫双扩散法，孔距0．5em， 抗原量5O#gCT／10#L， 加样俸积为1o#L)。用pH8．oH PBS 缓冲液(0．15mol／L NaCl-0．01mol／L Na2HPO4-NaHtPO^)充分平衡DE DE525g(温重) 加入以I：3稀释的免疫觅血清4mL，4℃ ， 隔10分钟搅拌一次，I，J、时后抽滤取下滤液。用7 oA 的聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定下滤液中IgG纯度，可达电泳一条带。用紫外吸收法对IgG定量， 每毫升血清可得IgG约8 mg。 5． 亲和柱的制备及层析 参考 免疫学与免疫化学技术》所介绍的方法 】，以lOmg IgG：lg cNBf．sepbar0日e 4B(湿重)的比侧，将抗CT的IgG偶联到琼脂糖载体上，用pH7．4 的PBS缓冲液充分平衡后装柱。取DE E2处理后的超滤浓缩液不断流经此柱， 用cT抗血清致 敏的SPA蛋白跟踪检测流出液， 直至流出渡呈现凝集反应阳性便停止加样 用pH7．4的PBS 冲洗层析拄， 至OD。日o=0．0后， 换用pH2．8的O．1mol／L甘氯酸一盐酸作为解离剂，分部收集 洗脱液。用GM -ELISA法检测各管洗脱液中CT—B的话性。合并有活性的各管，用PEG进行浓 缩， 并对pH7．4的PBS透析。 兰、分析技术 I． SDS-PAGE 浓缩胶3．5 ，分离破l5 ，TrY-甘氯酸不连续系统， 电诛后用考马 斯亮兰R250染色蛋白区带， 或用银染着色蛋白带。 2． 紫外吸收法定量蛋白。 3． 考马斯亮兰G250法定量蛋白[01。 4． GMJ-ELISA检测CT或CT-B【”，。 5． 致敏SPA凝集反应检测CT或CT—B。 6． 琼脂免疫单扩散定量CT或CT-B。 7． 璩脂免疫双扩散。 8． 微量免疫电泳Ⅲ 。 9， 凝胶渗透HPLCt岛津Lc一5A，Diol一150柱，本院药物毒物研究所代拴。 结 果 ～ 、培养物上清的趋滤浓缩 培养物上清经截留10kD分子量的超滤膜浓缩后， 所需活性物质绝大部份滞于上截留份 中，下滤液中有少量( ● ● 维普资讯 http://www.cqvip.com 换， 而某些杂蛋白则可被吸附于其上。经过DEs 处理， 可以达到除去部分杂蛋白的效果。用 GMr_ELISA定量DE 。处理前后样品液中CT-B的含量，可计算出此步回收达75％-90％。 二、免疫亲和柱层析 含有CT-B的DE 处理液流经偶联抗CTIgG 的琼脂糖凝胶柱时，CT-B与CTIgG结 合，杂蛋白流弃。酸性的甘氨酸一盐酸缓冲 液使抗原一抗体复合物解离， 洗脱下CT-B抗 原蛋白， 在波长280nm处显示出很高的吸收 峰(Fig．1)。用GM1-ELISA检测出的活性 蛋白峰形基本与OD一吸收峰同步， 由于此 方法检测灵敏度较高(1ng水平)， 所以 使图中所示活性峰较之紫外吸收峰略向后拖 延数管。我们用7g载体装成的层析桂提取 CT—B，每批可得产物1．2一1．5mg， 回收率 在70 以上。 ’ 兰、纯,fl：CT-B的鉴定 1． SDS-PAGE；用免疫亲和屡析分离的 产品经不连续系统SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳 后， 用考马斯亮兰R250染色，可以看到纯化 的工程菌产CT-B只显示一条着色带(Fig．2)， 其迁移位置与天然CT-B (Sigma)相同。我们 用灵敏的银染蛋白法获得同样的图谱。 Fig．2 SDS polyacrylamide gel electro— Phorepram 1． eholera toxin(Sigm a) 2． subunit A of cholera toxin(Sigma) 3． subunit B of cholera toxin(Sigm a) ． purified aT—B from E．coli(pM M2) 一0．3 J一 喜。 蓥M 0 01Ⅱ 1／L PB$pI{7 4 2 6 8 l{) ]2 E]uction fraction Fig． I A ffinity chrom atogrphy of the culture E．coli(pMM2)on CNBr—Sephar— ose—CTIgG column Fig． 5 H PLC of the dissoeiated purified CT—B from E． coli(pM M2) 2． 凝胶渗~HPLC；亲和层析分离得到的样品加．&SDS(终浓度0．1 )后通过Diol一150 29 维普资讯 http://www.cqvip.com 凝胶柱(岛津LC-5A)，流动相为0．~mol,／L Na2SO4—0．01mol／L PB(pH7．4)，在波长280rim 描述层析行为的吸收曲线， 呈现单一吸收高峰(Fig．3)； 用GM 一ELISA拴测该蛋白峰的 cT—B活性，为强阳性。在同样条件下， 购自Sigma的天然CT—B呈现与其完垒相同的单一峰 形(资料未示)。 3． 抗原性鉴定； 工程菌产CT-B在免疫琼脂双扩散中对霍乱毒素粗品抗血清(效价为 J：16)产生一条沉淀线， 此线与天然霍乱毒素、天然霍乱毒素B亚单位对同种血清产生的沉 淀线相融合(Fig．4)。微量免疫电豺c图中沉淀线的位置表明工程菌cT—B的迁移率与天然CTB 相同， 而霍乱毒素CT在该电场中较之CT-B更加偏向正极(Fig．5)。 Fig． 4 Im munodlffuston on agarose gel 】 IJurified CT—B from E．coli(pMM 2) 2． CT form V ．cholerae(Sigm a) 3 CT—B from V ．cholerae(Sigina) 4 the rabbit aFi'dserum to chotera toxin Fig．5 Mk raim munoo]cctrophoresis oil agarose gel 1． puI ifiod CT—B from E．coil(p～I I2) 2． CT—B from V．ohoIerao(Sigma) 3． CT from V ．cholerae(Sigm a) The rabbit antiserum to CT was added into the troughs． 讨 论 霍乱肠毒素是AB构型的细菌外毒素，A、B两种亚单位有各自的编码基因。本实验室构 建的E．eoli(pMl~i2)是仅带有霍乱肠毒素B亚单位完整基因的工程菌。载体质粒pUCD上带 Lac启动子， 引入的CT-B基因利用载体启动子及自身的SD序列得以表达， 产物分泌到胞外。 用截留量l万的超滤膜浓缩时， 活性物质绝大部份被截于上留份， 表明分泌出的CT-B链以 聚体形式存在于培养液。被纯化的表达产物在SDS-PAGE上分离鉴定结果证明该蛋白仅由 CT-B肽链构成，既非融合蛋白也不含其他肚段。胶滤HPLC中的单一峰表明纯化产f 的均一 性。工程菌产CT-B的抗原性与天然cT—B完垒一致，这一点不仅用免疫双扩散及免疫电洙的 ． 沉淀线可以证明， 免疫亲和层析纯他方法本身也就是一个很好的证明。 参考文献 f 1] Markel D E et a1． ， 8up．amol r 耐，1979I 10|187． f 2] Holmgren J．Gholeva 口td Related D~a~'rheae，49rd，Npbel Syrup．tStockholm 1978t 88-103 f 3] 0htome N et a1．J lnfsd Din，1976。133,S·31． f‘] 0htome N et a1．J lnf#ot D 8，1976。13DS-5． [9] Mekalanos J J．Im，e“ ， Ⅲm．1977 1 I~,789． 30 ● 维普资讯 http://www.cqvip.com ● [6] 马蒲钧肄． 中目科学(B辑)，198BJ 5,816． [ ] Finkelstein R A et a1． J Esperlm M agi@，196fll 130'185． [8] 北旺{置生钎教研室．免疫学与免症化学拉木，北京，北京医学院，19TSt 2蝣． 9] 徐宜为．实验免疫学技术，北京科学出版杜，1979 199． El O] Sack D A oL a1． J “ 月M icrvbiolJ 1980- 11。35． The Purification of Cholera Toxin B Subunit From Carrying gecombinant Plasm id Containing E ．Coli Strain Xiong，Ling—shuang Ma，Qing-jun Zhang，Yan-huong (f口。 Ⅱ e 0，Biologioat Engineering，Academy ol Milita~'y Medical Eciegce8，Beiji~g) Abst ract The recombinant plasmid pMM2 contained cholera enterotoxin B subunit gene CT-B were expressed in E ． eoli strain． Cholera toxin B subunit was purif— ied by immun0affi nity chromat0gr Phy from culture supernatant of the strain by us— iag cNBr．sepharose 4B coupled with CT—IgG aa affinity medium．The purified product is homogeneous and identical with the B 9uhnnit from wild V ． cholera strain as shown by SDS—PAGE， HPLC and imm unodiffusion ． Key words： cholera toxin， purification of protein， affinity chr0matogr Phy 《生物化学杂志》论文中参考文献著录格式说明 本刊文后参考文献采用顺序编码制，编排格式从第六卷起按照国家标准GB77714-87规 定， 示倒如下l 1． 期： 科 作者．期刊名，年，卷(期)：起止页。 。 (1) Zeng G C et a1．Mol Cell Piol， 1984~ 44：l8l5一l822． (2) Hand R，Gautschi J R．J Cell Biol， 1979~ 82：485- 493． (3)王维通等． 生物化学杂志，1986；2：89． 2． 书籍： 作者，(In或见：主编者ed)。书名，(卷)版班， 出版地： 出版者， 出版年：起止页 (1) Griffin B E．In：Tooze J ed The Molecular Biology of Tumor Viruses，New Youk： Cold Spring Harbor Laboratory， 1980： 6l— l24． (2)张尤翔等．生化实骚方法和技术，北京； 高等教育出版社，1981：112． 31 |
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