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浅析影响大肠杆菌外源基因表达的三种表达载体
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大量正确折叠表达的重组蛋白促进了药物的发现以及发展，这些药用重组蛋白普通用于治疗各种疾病，也可以作为筛选新药物的靶蛋白。大肠杆菌表达系统具有生长速度快、基因操作方便、表达水平高、培养周期短、抗污染能力强和重组蛋白合成速度快等优点，使它成为表达多种重组蛋白最令人满意的宿主之一。 一个完整的大肠杆菌表达系统至少要有表达载体和宿主菌两部分构成。在中国CRO公司排名中靠前的美迪西建立了成熟的大肠杆菌表达及纯化服务平台，提供包括各种重组蛋白以及其复合物在大肠杆菌中的表达与纯化服务。表达载体是表达系统的核心，在大肠杆菌表达系统中有很多的载体可以表达外源基因。一般来说大肠杆菌表达载体应满足下列条件①重组质粒有较高拷贝数且表达量高。②适用范围广。③稳定性高。④表达产物容易纯化。表达载体主要包括启动子、表达阅读框、终止子、复制起点以及抗性筛选标记等重要元件。 目前已知应用较广的大肠杆菌表达载体有:融合表达、分泌型表达载体和共表达载体这三种。 1、融合表达载体 表达融合蛋白的一般模式为原核启动子—原核SD序列与起始密码—原核结构基因片段—目的基因序列—原核终止密码子。该表达载体可以插入目的基因之外的辅助基因序列，并且与目的基因构成融合蛋白基因序列进行表达，可以提高外源蛋白的活性和产量，并且可以简化下游纯化的操作等。融合蛋白基因与外源基因结合，可以利用融合信号肽将融合蛋白分泌到细胞周质或胞外表达，有利于形成二硫键以及避免胞质蛋白酶的水解，同时有利于目的蛋白的分离和纯化。研究表明，成功的融合表达载体包括GST（谷胱甘肽转移酶）系统、半乳糖苷酶系统、麦芽糖结合蛋白（MBP）系统、硫氧还蛋白系统、蛋白A系统、纯化标签融合系统等。 2、分泌型表达载体 外源蛋白在大肠杆菌细胞内容易被宿主体内的蛋白酶降解，同时为了外源蛋白质能够分泌到宿主体外进行正确折叠修饰和便于提纯，所以被表达的外源蛋白需要分泌到宿主体外，因此分泌型载体是实现此步骤的关键因素。表达分泌蛋白防止宿主菌对外源蛋白的降解，同时减轻宿主细胞代谢负荷及对产物进行胞外正确折叠修饰，使其具有真正的生物学活性。 一些在胞内被蛋白酶降解的蛋白质在细胞周质中很稳定；一些在胞内无活性的蛋白质分泌后便具有活性，分泌可能使蛋白能够正确折叠；产生的蛋白质没有氨基酸末端甲硫氨酸，因为切割位点在信号肽与编码序列之间，甲硫氨酸会影响许多蛋白质的活性。 3、共表达载体 绝大多数真核基因表达的产物若要表现出相应的生物活性都必须以多聚复合体的形式组合，因此构建共表达载体来表达这类外源基因是表达产物有无活性的最关键一步，同时新生蛋白质在后期的折叠和分泌过程中共表达策略也起到至关重要的作用。有研究人员构建了可与pET载体共表达的载体pOKD，用于表达异源二聚体外源基因，这种载体可以与大多数大肠杆菌表达载体共存于细胞中。还有研究者设计了共同表达分子伴侣的3载体系统，其中2种载体分别携带不同的分子伴侣，另外1种载体携带目的基因，分子伴侣与目的基因被分别独立诱导。例如，从嗜冷菌中分离的一类分子伴侣Cpn60和Cpn10共同表达后，可以使大肠杆菌在4℃低温下生长，这样的环境有利于蛋白的正确折叠，有利于提高表达产物的活性和产量。 目前在科研和工业上被广泛应用的大肠杆菌表达载体主要有pGE系列、pQE系和pET系列，其中目前被广泛应用的高效表达载体是pET。此系统是在大肠杆菌中表达外源蛋白最高效、成功率最高的表达载体。pET表达载体最初是利用与启动子配套并且能够高效转录特定基因的外源RNA聚合酶构建的T7RNA聚合酶/启动子系统，可以从各种基因包括原核细胞、真核细胞生产大量的目的蛋白。 如今大肠杆菌表达外源基因的技术越来越成熟，为今后的科学研究和大规模工业生产提供了极大的可能性和经济价值，但是目前仍然有关键问题需要解决，因为还有一部分与外源蛋白表达相关的调控通路未知，有些与大肠杆菌代谢途径对外源基因表达影响的因素没有解决。 在大肠杆菌中制备生物药制品时，目标蛋白可以在胞内以不可溶的蛋白聚合物的形式表达为包涵体，还表达为可溶的分泌型蛋白。然而这种表达系统还存在一些缺点重组制品的制备为非功能状态，这是因为在大肠杆菌中不能进行翻译后修饰。如果蛋白以包涵体的形式表达，下游过程是十分繁琐的。在大肠杆菌中包涵体的形成是由于所需细胞器的缺失以及外源蛋白在细胞质中的过表达。为了克服这些挑战，在大肠杆菌的周质腔或者在胞外空间通过合并合适的信号肽序列来表达重组蛋白，这种表达方式可以使蛋白正确折叠并可使蛋白水解尽量降到最低。这种信号序列可以从自然界获得，也可以通过先进的生物信息学工具设计合成。大肠杆菌BL21(DE3)和K12宿主已被广泛用于制造各种生物药制品。 |
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