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小汰宝金虫 (正式写手)
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[求助]
易错PCR的时候，锰离子浓度都0.5mM了，还是没突变。 已有1人参与
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我们在做一个2400bp片段的易错PCR，不知道为啥不管添不添加镁离子锰离子，只要用Taq酶P，就是有太多非特异性扩增 于是我们加了5%二甲基亚砜，非特异性扩增问题解决了 于是在这个基础上做易错PCR，有几点有疑义的地方： ①锰离子浓度试了0.5mM 1mM 1.5mM 2mM 2.5mM 3mM 并未出现如前辈告知的“随着锰离子浓度升高，PCR产物的量会减少”的现象，多少锰离子都一样的亮...... 为啥呀 ②送测了0.5mM 锰离子浓度的PCR后胶回收产物，测序结果显示没突变... 前辈告知0.5mM 锰离子浓度已经很高了，但是为什么2400bp里一个突变都没出现... 期间还怀疑过是不是纯化后的胶回收产物里比如有1000条基因片段，可能在某一位置只有一个基因片段上有突变，所以测序测不出来？ 所以也送了连接产物，发现还是没突变... 二甲基亚砜是不是会提高PCR保真性啊？一直没有突变出现，是不是二甲基亚砜导致的.... ③镁离子用的硫酸镁，锰离子用的氯化锰，有影响嘛？ 其实后面连接也有很大问题...但这里想先解决突变率的问题，麻烦大神们帮忙看看，蟹蟹蟹蟹 附PCR体系： 水：8uL 质粒模板（约50-100ng/uL）：5uL 引物（10umol/L）:1/1uL 10XBuffer（含MgSO4 20mM）:2.5uL dNTPs:2.5uL MgSO4（50mM）:2.5uL (镁离子终浓度7mM) MnCl2(50mM):0.25uL（锰离子终浓度0.5mM） 二甲基亚砜：1.25uL Fast Taq酶：1uL@biostar2009 |
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2楼2018-10-27 23:13:56