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[求助]
真诚求助！人原代胎盘干细胞提取方法
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本人小学硕一枚，最近因课题需要用胎盘间充质干细胞，开始艰难的提取。 参考了很多文献，反反复复用了十几个胎盘，发现并不能提取到胎盘干细胞呢QAQ绝望，各文献的步骤都不大一样，有的用胰酶，有的用胶原酶，离心的g也差别很大，很迷茫 附上提取步骤，希望做相关课题的小伙伴交流交流，看看我的问题到底出在哪～ 1.用含2%双抗的生理盐水清洗蜕膜表面除去血液，剪除胎盘母体面最上层的蜕膜，从剩余胎盘中剪取60-80g绒毛组织（不包括蜕膜、结缔组织、血管等，尽量去除这些组织）放入盛有含2%双抗的生理盐水的无菌培养皿中。反复多次用含2%双抗的生理盐水漂洗，漂洗后的胎盘组织重新放入另一含2%双抗的有生理盐水的培养皿中以保持湿润。 2.将胎盘组织转移至培养皿中并剪碎（2mm大小），剔除结缔组织及血凝块。将剪碎后的组织从新转移至盛有生理盐水的培养皿中，并用生理盐水冲洗，冲洗完成后经70μm滤器过滤，弃废液。 3.将剪碎后的组织转移至含100 U/mL I型胶原酶和5 μg/mL DNase I的DMEM-LG中，并置于培养箱中消化2-3h。 4.消化完成后，加入等量含10%胎牛血清的DMEM-LG终止消化，离心去除较大颗粒（540g，5 min, 20℃），然后经70μm滤器过滤至一个新50ml离心管中。沉淀中加入15mL无菌生理盐水或PBS反复震荡，将沉淀中的细胞洗脱成细胞悬液，并将悬液一并加入新50ml离心管。 5.将50ml离心管中的细胞液离心(540g, 5 min, 20℃)，然后重悬在PBS，再加入已盛有1.073 g/mL FicollTM（该试剂位于底层，不能与细胞悬液混合）中，加入的细胞样本与FicollTM比例为4:3，然后离心（540g，20 min, 20℃）。 6.离心结束后，去除最上层液体，加入单层细胞约3倍体积的生理盐水或PBS重悬，然后离心（540g，10min, 20℃），弃上清液。 7.细胞沉淀中加入单层细胞约3-4倍体积的生理盐水或PBS重悬，然后离心（300g，5 min, 20℃），弃上清液，用相应的培养基重悬细胞沉淀。 |
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