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细胞转染技术之脂质体转染
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脂质体是磷脂分散在水中时形成的脂质双分子层，又称为人工生物膜。具有膜的融合及内吞作用，可用作外源物质进入细胞的载体，研究表明脂质体能把DNA十分有效地引入动物细胞中。脂质体介导转染法也是常见的细胞转染技术服务之一，具有很多优点，其操作简单、转化效率比较高，可以用于瞬时转染，也可以用在永久表达系的建立。 一些生物公司提供的细胞转染技术服务可用于分析细胞内基因及基因产物功能，细胞转染技术不仅是基因功能研究、基因免疫的理论和技术基础，也是研究基因表达调控、突变分析等的常规工具；同时也是体内应用的重要过程，比如基因治疗、疫苗接种、药物开发等。美迪西提供细胞转染技术服务。 脂质体转染适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前实验室最方便的转染方法之一，其转染率较高，优于磷酸钙法。由于脂质体对细胞有一定的毒性，所以转染时间一般不超过24小时。 1、脂质体的制备方法 脂质体的制备主要有超声波法、磷脂酰丝氨酸钙离子融合法和逆相蒸发法等，用超声波法可制备的单层或多层脂质小体能向细胞内引入的物质量少，故常用后两种方法制备大的脂质体。阳离子脂质体转染技术是脂质体转染法中高效便捷的转染方法。 阳离子脂质体表面带正电荷，能与核酸的磷酸根通过静电作用，将DNA分子包裹入内，形成DNA-脂质体复合物，也能被表面带负电的细胞膜吸附，再通过融合或细胞内吞进入细胞。 2、脂质体转染步骤 (1)细胞培养 取6孔培养板(或用35mm培养皿)，向每孔中加入2mL含细胞培养液，37℃CO2培养至40%~60%汇合时。汇合过分，转染后不利筛选细胞。 （2）转染液制备 在聚苯乙稀管中制备以下两液为转染每一个孔细胞所用的量。A液：用不含血清培养基稀释1-10μg DNA，终量100μL；B液：用不含血清培养基稀释2-50μgLR，终量100μL，轻轻混合A、B液，室温中置10-15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染，如出现沉淀可能因LR或DNA浓度过高所致，应酌情减量。 （3）转染准备 用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入1mL不含血清培养液。 （4）转染 把A/B复合物缓缓加入培养液中，摇匀，37℃温箱置6~24小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。其余处理如观察、筛选、检测等与其它转染法相同。 注意：转染时切勿加血清，血清对转染效率有很大影响。 3、脂质体转染注意事项： （1）细胞的状态 细胞状态的好坏是影响转染效率的关键因素，为了达到最佳的转染效果，转染细胞一定要处于最佳的生长状态。一般情况下，转染的细胞不要超过17代或者不要小于3代，最好是重新复苏细胞后培养三代，然后用来转染最佳。 （2）细胞的密度 转染前细胞的密度最好达到90%左右，细胞太少，转染后细胞容易死，细胞太多，转染效率会下降。 （3）转染时间 转染后，使用无血清培养基培养OPTI-MEM最多5~6小时，5~6小时以后必须更换新鲜培养液，因为长时间无血清培养基OPTI-MEM培养会对细胞产生毒性作用，导致细胞死亡。 （4）质粒浓度 转染的质粒浓度不能太低，质量不能太差，所以用于转染的质粒在抽提时最好使用去除内毒素的试剂盒来抽提，抽提过程中预防污染。 （5）检测时间 根据不同的细胞，转染后基因表达的时间不同，如果仅仅是检测质粒表达情况，一般转染24小时即可。 利用脂质体转染法最重要的就是防止其毒性，因此脂质体与质粒的比例，细胞密度以及转染的时间长短和培养基中血清的含量都是影响转染效率的重要问题，通过实验摸索的合适转染条件对于效率的提高有巨大的作用。 |
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