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Western印迹分析在研究NM23B基因细胞增殖作用上的应用
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NM23是一个肿瘤转移抑制基因，其对细胞的增殖、分化和个体发育具有调控功能。目前NM23已经发现10个亚型，研究较为透彻的是NM23A和NM23B，运用western印迹分析发现NM23B对体外培养的SD大鼠具有肝细胞增殖作用。western印迹分析又称免疫印迹分析，是根据抗原、抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。 由于免疫印迹具有 SDS-PAGE 的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，可检测低至1-5ng（最低可到10-100pg）中等大小的靶蛋白，现已成为蛋白分析的一种常规技术，也是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法，美迪西生物医药可以提供蛋白印迹实验技术服务。免疫印迹常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析。 1、nm23蛋白的作用机理 nm23蛋白与果蝇的awd蛋白和二磷酸核苷激酶（ndpk）这两类蛋白高度同源: （1）果蝇的awd蛋白 人的nm23蛋白与awd蛋白的氨基酸序列有77%～78%是相同的，awd蛋白在果蝇胚胎发育上起重要调节作用，如awd基因突变或表达降低，将导致果蝇的许多组织器官的畸形分化和翅盘细胞的死亡。据此推测nm23蛋白可能是正常组织发育所必须的，如果nm23蛋白失活或减少将导致一种有利于畸形分化和肿瘤转移的紊乱状态。 （2）二磷酸核苷激酶（ndpk） 二磷酸核苷激酶（ndpk）是细胞中普遍存在的一种多功能同质酶家族，主要分布于胞浆和质膜上，功能涉及依赖ntp（三磷酸核苷）的细胞活动过程。ndpk通过催化这一反应影响微管聚合、纺锤体形成并调节细胞运动。其异常一方面引起细胞染色体非整倍体畸变而破坏细胞正常形态结构及促进肿瘤发生，另一方面通过影响细胞骨架对细胞信号反应的改变，引起细胞运动而参与浸润转移。nm23蛋白显示有ndpk活性，因此很可能通过与ndpk一致或相似的途径在调节细胞信号传导、细胞分化等过程中发挥作用。 2、NM23促进细胞增殖 观察NM23B在体外培养大鼠肝细胞增殖中的作用，方法是构建NM23B过表达载体和干扰载体及其阴性对照载体，分别转染SD大鼠BRL-3A肝细胞，并设空白对照组（CON）、干扰NC组（siRNA-NC）、干扰组（siRNA）、过表达组（OE）、过表达NC组（OE-NC），通过定量PCR分析各组细胞中Cyclin D1、NM23B和PCNA的mRNA变化。 Western印迹分析比较各组细胞中Cyclin D1、NM23B和PCNA蛋白的变化，流式细胞仪检测各组细胞周期比例，用细胞增殖-毒性检测（CCK 8）法检测细胞增殖。结果发现 （1）过表达组OE组Cyclin D1、NM23B和PCNA的mRNA及蛋白的表达量较CON组显著增多（P<0.05）。 （2）另一方面干扰组siRNA组的Cyclin D1、NM23B和PCNA的mRNA及蛋白的表达量较CON组显著降低（P<0.05），干扰NC组和OE-NC组与CON组相比无统计学差异（P>0.05）； （3）OE组的G0/G1期细胞比例明显低于CON组（P<0.05），siRNA组的G0/G1期细胞比例明显高于CON组（P<0.05）。同时OE组的S期细胞比例明显高于CON组（P<0.05），siRNA组的S期细胞比例明显低于CON组（P<0.05），siRNA-NC组和OE-NC组与CON组相比无统计学差异（P>0.05）。 CCK-8检测细胞增殖表明OE组的增殖速度明显快于CON组（P<0.05），siRNA组的增殖速度明显慢于CON组（P<0.05），siRNA-NC组和OE-NC组与CON组相比无统计学差异（P>0.05）。 因此过表达NM23B可以加强Cyclin D1、PCNA的表达，缩短细胞周期，从而促进肝细胞增殖；干扰NM23B表达则削弱了Cyclin D1、PCNA的表达，延长细胞周期，从而抑制肝细胞增殖。证实了NM23B在体外培养SD大鼠肝细胞增殖中的作用，为后续体内实验奠定了理论基础。 3、nm23与肿瘤的关系 nm23基因具有抑制肿瘤转移的作用，在体外转染实验以及动物实验中得到证实。在对黑色素瘤的细胞克隆研究中，发现nm23明显抑制了黑色素瘤细胞的癌变过程，包括抑制了细胞活性、抑制肿瘤的发生、抑制肿瘤的转移和改变了黑色素瘤的应答。近年来，临床检查发现，nm23的表达与各种肿瘤的侵袭及转移呈负相关，而且对患者预后有重要影响。 研究表明，nm23基因的抑瘤作用具有组织特异性:在一些肿瘤，如乳腺癌、肝癌、恶性黑色素瘤、卵巢癌等，nm23的蛋白表达与肿瘤转移及临床预后不良呈负相关，其基因缺失与肿瘤转移密切相关，显示了它作为肿瘤转移抑制基因的特性；而在另一些肿瘤，如肺癌、前列腺癌、膀胱癌、神经母细胞瘤、骨肿瘤、子宫内膜癌等，nm23基因的表达水平、缺失与肿瘤转移似乎无关，但却与肿瘤分化、增生和进展有关；甚至在一些肿瘤，如神经母细胞癌，当其恶化或转移时，nm23的表达量反而增高，似乎其表达水平增高与癌细胞增生相关。这些结果说明nm23基因不仅作为一个肿瘤转移抑制基因而起作用，尚还有更多的其它生物学功能。 因此nm23基因不仅仅具有细胞增殖租用，还具有执行肿瘤转移抑制功能。然而nm23基因并非在所有类型肿瘤中都表现为癌转移的抑制功能，研究表明其作用具有组织差异性，出现这种差异性的机制尚不明确，说明人们对nm23基因的全面认识还远未完成，尚需进行更深入的研究。 |
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