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四唑盐(MTT)比色试验
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原理：ＭＴＴ法建立于20世纪80年代初，是一种通过测定细胞能量代谢水平用以间接反映细胞增殖情况的检测方法。其原理是MTT可作为哺乳类动物细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶的底物。当有活细胞存在时，线粒体内琥珀酸脱氢酶可将淡黄色的MTT还原成紫蓝色的晶状甲瓒(Formazan)，将结晶的甲瓒溶解释放，再用酶联免疫检测仪测定吸光度OD值，OD值的高低可间接反映活细胞的数量及其活性。活细胞多则吸光度大，反之则吸光度小，从而反映出你的细胞的存活及增殖情况。它基于两个假设：1、只有活细胞能够将MTT还原成为难溶性的蓝紫色结晶物，而死细胞不能达到；2、其吸光度与活细胞数量成直线正相关。 所需原料： 1、MTT溶液：称取250mg MTT，放入小烧杯中，加50mlPBS(0．01mol／L， pH7．4)，在电磁力搅拌机上搅拌30min，用0.22um的微孔滤器除菌，分装，4℃保存。两周内有效。2、含l0％胎牛血清RPMl 1640培养液、o．25％胰蛋白酶二甲基亚砜(DMSO)3、96孔培养板(单层生长的细胞选用平底型培养板，悬浮生长的细胞选用圆底型培养板)、可调移液器、吸管、离心管、计数板 4、孵箱、显微镜、振荡混合仪、酶联免疫检测仪 操作步骤： 1、接种细胞：用o．25％胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含 10％胎牛血清的RPMlt604培养液配成单个细胞悬液，以每 孔100－1000个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积200ul。 2、培养细胞；将培养板移入CO2孵箱中，在37℃、5％CO2及湿度条件下，培养3—5天。(培养时间取决于实验目的和要其求) 3、呈色：培养第2—5天后，每孔加入MTT溶液(5mg／m1)20ul，37℃继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。对浮生长的细胞，需离心,(1000rpm．5min)，然后弃去孔内培养每孔加入150ul DMSO，振荡10min，使结晶物充分溶解。 4、比色：选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上调定各孔收值，记录结果。以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生线。 注意事项： 1、 选择适当的细胞接种浓度。由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行MTT试验前，对每一种细胞都应测定其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证适时终止细胞培养。这样，才能保证MTT结晶形成量与细胞数呈的线性关系。 2、 避免血清干扰。用含15％胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。因此，一般选小于lo％胎牛血清的培养液进行。在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。 3、 设空白对照。与试验孔平行设不加细胞只加培养液的空白孔。其它试验步骤保持一样。最后比色时，以空白孔调零。 4、 加样器操作要熟练，尽量避免人为误差。虽然移液器比移液管精确得多，但是如果操作不熟，CV会在8%左右。 5、 如果用96孔板，周围一圈孔的值由于液体蒸发和温度梯度原因，存在明显的挥发现象，会误差很大， 所以做的时候要求培养箱里的湿度条件控制的比较好, 要不就需要弃取周围两轮孔的数据。 6、 MTT有毒性致突变性，操作时应注意防护。 7、 MTT主要优点： 1、有灵敏度高，重复性好， 2、操作简便、经济、快速、易自动化的优点， 3、没有试验放射性污染， 4、可以减少如细胞计数法、软琼脂克隆形成试验中的人为性因素 8、 小窍门： 1、贴壁细胞效果好，悬浮细胞要离心2500rpm×10min，室温, 再吸去培养液，加入DMSO。 2、如果实验孔不多，DMSO加入后可以用枪头吹打混匀，比振荡溶解效果好。 3、细胞分板时，要充分分散，而且要加几个孔就重新吹散一次，否则，细胞浓度就会不同。另外，吹散次数过多也会影响细胞活力。所以要熟练些，快些上板。 4、培养后，细胞的培养既要吸干净，否则，残留的蛋白会对ＭＴＴ有一定的吸附作用，影响就过准确性。 5、贴壁细胞一般在试验前1-2日接入９６孔板。太晚，细胞在传代后有一个１６小时左右的停滞期，此时代谢变慢，增殖缓慢，及对数曲线的底部，此时的MTT数值太低了；太早了，实验时候，细胞生长过头，此时有死亡和凋亡的细胞，实验时本底又过高。让试验时落在对数早中期最好 6、OD值尽量控制在0.3-0.6之间； 肿瘤细胞培养 肿瘤细胞培养是研究癌变机理、抗癌药检测、癌分子生物学极其重要的手段。肿瘤细胞培养对阐明和解决癌症将起着不可估量的作用。肿瘤细胞培养方法与培养正常细胞完全相同，但成功率比正常细胞高。 肿瘤细胞与体内正常细胞相比，不论在体内或在体外，在形态、生长增值、遗传性状等方面都有显著的不同。生长在体内的肿瘤细胞和在体外培养的肿瘤细胞，其差异较小，但也并非完全相同。培养中的肿瘤细胞具以下突出特点：○1培养中癌细胞无光学显微镜下特异形态，大多数肿瘤细胞镜下观察比二倍体细胞清晰，核膜、核仁轮廓明显，核糖体颗粒丰富。电镜观察癌细胞表面的微绒毛多而细密，微丝走行不如正常细胞规则；○2肿瘤细胞在体内具有不受控增殖性，在体外培养中仍如此；○3永生性，也称不死性。在体外培养中表现为细胞可无限传代而不凋亡（Apoptosis）；○4 浸润性：浸润性是肿瘤细胞扩张性增殖行为，培养癌细胞仍持有这种性状；○5 异质性：所有肿瘤都是由有增殖能力、遗传性、起源、周期状态等性状不同的细胞组成； ○6大多数肿瘤细胞有遗传学改变，如失去二倍体核型、呈异倍体或多倍体等。 肿瘤细胞培养成功关键在于：取材、成纤维细胞的排除、选用适宜的培养液和培养底物等几个方面。在具体培养方法方面，肿瘤细胞培养与正常组织细胞培养并无原则差别，初代培养应用组织块和消化培养法均可。 肿瘤细胞培养步骤： 1．取材： 人肿瘤细胞来自外科手术或活检瘤组织。取材部位非常重要，体积较大的肿瘤组织中有退变或坏死区，取材时尽量避免用退变组织，要挑选活力较好的部位。癌性转移淋巴结或胸腹水是好的培养材料。取材后宜尽快进行培养，如因故不能立即培养，可贮存于4℃中，但不宜栽过24小时。 2．培养基： 肿瘤细胞对培养基的要求不如正常细胞严格，一般常用的 RPMIl640、 DMEM、Mc-Coy5A等培养基等皆可用于肿瘤细胞培养。肿瘤细胞对血清的需求比正常细胞低，正常细胞培养不加血清不能生长，肿瘤细胞在低血清培养基中也能生长。肿瘤细胞对培养环境适应性较大，是因肿瘤细胞有自泌（Autocrine）性产生促生长物质之故。但这并不说明肿瘤细胞完全不需要这些成分。按不同细胞需要不同的生长因子；肿瘤细胞与正常细胞之间、肿瘤细胞与肿瘤细胞之间对生长因子的需求都存在着差异。但大多数肿瘤细胞培养中仍需要生长因子。有的还需特异性生长因子〔如乳腺癌细胞等）。总之培养肿瘤细胞仍需加血清和相关生长因子培养更易成功。 3．成纤维细胞的排除： 成纤维细胞常与肿瘤细胞同时混杂生长，致难以纯化肿瘤细胞。而且成纤维细胞常比肿瘤细胞生长得快，最终能压制肿瘤细胞的生长。因此排除成纤维细胞成为肿瘤细胞培养中的关键。 a．机械刮除法：用不锈钢丝末端插有橡胶刮头（用胶塞剪成三角形插以不锈钢丝）、或裹少许脱脂棉制成，装入试管中高压灭菌后备用（也可用特制电热烧灼器刮除）。刮除程序为： （1）标记：镜下观察，用不脱色笔在培养瓶皿的背面圈下生长肿瘤细胞的部位； （2）刮除：弃掉培养液，把无菌胶刮伸入瓶皿中，肉眼或显微镜窥视下，刮除无标记空间； （3）用Hanks液冲洗一两次，洗除被刮掉的细胞； （4）注入培养液继续培养，如发现仍有成纤维细胞残留，可重复刮除至完全除掉 b．反复贴壁法：根据肿瘤细胞比成纤维细胞贴壁速度慢的特点，并结合使用不加血清的营养液，把含有两类细胞的细胞悬液反复贴壁，使两类细胞相互分离，操作方法与传代相同。 （1）待细胞生长达一定数量后，倒出旧培养液，用胰酶消化后，Hanks冲洗2次，加入不含血清的培养液，吹打制成细胞悬液； （2）取编号为此A、B、C三个培养瓶；首先把悬液接种入A培养瓶中。置温箱中静止培养5～20分钟后，轻轻倾斜培养瓶，让液体集中瓶角后慢慢吸出全部培养液，再接种入B培养瓶中后；向A瓶中补充少许完全培养液置温箱中继续培养； （3）培养B瓶中细胞5～20分钟后，接处理A的方法，把培养液注入C培养瓶中；再向B瓶中补加完全培养基。 当三个瓶内都含有培养液后，均在温箱中继续培养。如操作成功，次日观察可见A瓶主要为成纤维细胞，B瓶两类细胞相杂，C瓶可能主要为癌细胞。必要时可反复处理多次，直至癌细胞纯化为止。 c．消化排除法： （1）先是用0.5%胰蛋白酶和0.02％EDTA（1：1）混合液漂洗培养细胞一次，然后再换成新的混合液继续消化，并在倒置显微镜下窥视和不时摇动培养瓶，到半数细胞脱落下来后，便立即停止消化； （2）把消化液吸入离心管中，离心去上清，吸入另瓶中，加培养液置温箱中培养；向原瓶内也补加新的培养液继续培养。用此法处理后，成纤维细胞比肿瘤细胞易先脱落。经过几次反复处理，可能把成纤维细胞除净。 d．胶原酶消化法：利用成纤维细胞对胶原酶较为敏感的特点，通过消化进行选择。 （1）可用0.5mg/ml的胶原酶消化处理，边消化边在倒置显微镜下窥视，当发现成纤维细胞被除掉后，即终止消化； （2）用Hanks洗涤处理一次后，更换新培养液，继续培养，可获纯净肿瘤细胞。如成纤维细 胞未被除净，可再次重复。 e．其它方法：有人发现聚丙烯酰胺有抑制成纤维细胞生长的作用；也有人用聚蔗糖制备成比重1.025～1.085的密度梯度离心液，加入细胞悬液后，在23℃中800g离心 10分种。在比重1.025～1.050层为成纤维细胞，在比重1.050～1.085层为上皮细胞，再经过分离进行培养。最近也有人应用特殊化学物如SOD抑制成纤维细胞生长的方法。 肿瘤细胞在体外不易生长的原因： 1、 依赖性：肿瘤细胞虽有较强克隆生长力，但仍有一定的群体性或与其它细胞 相依存关系。一是肿瘤细胞与肿瘤细胞的相互依存，二是肿瘤细胞与基质成纤维细胞的依赖。体外分散培养和排除成纤维细胞后也会同时消除或减弱这些依存关系，可能影响癌细胞增殖生长的活性； 2、 肿瘤细胞的自泌也会因分散培养而被稀释，达不到肿瘤生长的需求，降低 肿瘤细胞的生长增殖力； 3、 并非所有肿瘤细胞都有强的生长活力和长的Life Span，只有干细胞才有 强的增殖生长能力，但这些细胞数量很少； 4、 离体培养肿瘤细胞可能需求与体内相似的特殊生存条件。 提高肿瘤细胞培养存活率和生长率措施 根据人们的经验，肿瘤细胞在体外不易培养，建立能传代的肿瘤细胞系更为困难。当肿瘤组织或细胞初代接种培养后，常出现以下几种情况： 1、完全无细胞游出或移动； 2、有细胞移动和游出，但无细胞增殖，细胞长时间处于停滞状态以致难以传代； 3、有细胞增殖，传若干代后停止生长或衰退死亡； 4、传数代后细胞增殖缓慢，经过一段停滞期后，才又呈旺盛生长状态，形成稳定生长的肿瘤传代细胞系。 以上现象说明肿瘤细胞对体外生存条件有较高的要求，并需经过对新环境的适应才能生长，因此欲获得好的培养效果，不能局限于一般培养法，必须采用一些特殊的措施。 1．适宜底物： 把经过纯化的细胞接种在不同的底物上，如鼠尾胶原底层、饲细胞层等。 2．生长因子： 应用促细胞生长因子，向培养液中增加一种或几种促细胞生长因子。根据细胞种类不同选用不同的促生长物，常用有胰岛素、氢化可的松、雌激素以及其它生长因子。 为提高肿瘤细胞对体外培养环境的适应力和增加有活力癌细胞（干细胞）的数量，可采用动物体转嫁接种成瘤后，再从动物体内取出进行培养，能提高体外培养的成功率。受体动物以裸鼠最好。 3.动物体媒介培养方法： （1）瘤块接种：取新鲜瘤组织，用Hanks液洗净血污，切成1～3毫米小块，用穿刺针头吸一小瘤块，用酒精棉球擦拭动物腹部后，直接刺入皮下，注入瘤块； （2）饲养观察，待肿瘤生长达较大体积后，剥取出瘤组织； （3）进行体外培养。 （4）为防止失败，仍取部分瘤组织继续在裸鼠体内传代。通过裸鼠媒介接种，有活力的肿瘤细胞数量增多，细胞培养易于成功。 在原代培养时应注意的问题 (1)培养材料应取自肿瘤细胞集中、活力较好的部分，取材后应立即培养并存放于培养 液中。 (2)取材和培养过程中要防止细菌和霉菌污染。 (3)培养物中混有的成纤维细胞要尽快清除。 (4)癌组织中若有淋巴细胞浸润，应采用密度离心法将淋巴细胞清除，否则癌细胞会被杀死。 (5)实验要防止其他细胞株的交叉污染。 http://www.360yiqi.com/bbs/plugin/spread/?uid=754 [ Last edited by xujb123 on 2009-4-11 at 09:15 ] |
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