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[交流]
如何看载体图
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对于载体图,我有一些不明白的地方,希望大家能够交流一下 1有些载体上有LB和RB,这个具体指的是什么, 2为什么有些载体上的MCS会在启动子的前面,我有一个载体,上面有2个35S启动子,是相邻的,但朝着相反的方向,在它们中间是MCS,(图上标明时两个箭头的尾部很近,中间只有MCS),那么选择时如何确定上下游引物的酶切位点 3有些载体上标的MCS只有少数的几个酶切位点,而另外一个地方没有标明MCS,但有很多酶切位点,那么这两个地方的酶是不是都能用. 不知表述清楚了没,呵呵 先谢谢了!! 这两个图是从别人那里拷过来的,跟我说的情况比较类似 [ Last edited by 小猫三两只 on 2009-4-10 at 07:51 ] |
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小猫三两只(金币+7,VIP+0):非常感谢,我又上传了两个载体图:1391中是不是有两个35S启动子,下面的是启动潮霉素基因,如果要插入基因是不是应该先用最上方的那些酶切位点,另外在LB和RB之间.,只有潮霉素,转化时可不可以选择在这之外的Kana筛选. 而3301就是我说的第二条,能否解释一下. 4-10 07:57
小猫三两只(金币+7,VIP+0):非常感谢,我又上传了两个载体图:1391中是不是有两个35S启动子,下面的是启动潮霉素基因,如果要插入基因是不是应该先用最上方的那些酶切位点,另外在LB和RB之间.,只有潮霉素,转化时可不可以选择在这之外的Kana筛选. 而3301就是我说的第二条,能否解释一下. 4-10 07:57
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LB全称是left border RB是right border, 一般标有LB,RB的为双源载体,看你的问题估计你和我们见的一样是植物转化载体,那么,LB和RB也就是说,在这两个边界的中间的部分就是在转化植物时可以整合到植物基因组上的片段. 2.MCS在启动子前面是看情况的,可能你所看到的启动子只是启动下游筛选基因用的,而MCS则是要克隆你基因及基因本身启动子用的.对于你后面的问题,只能你把图发上来再解释看了. 3.所谓MCS位点,只是一些常见的内切酶,可能别的地方也有酶,但未必是常见酶,而且一般载体图都会把所有的酶切图谱发上来,以保证你设计相应的克隆策略. |
2楼2009-04-09 22:47:32
3楼2009-04-10 08:08:37
wjswj
木虫 (正式写手)
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4楼2009-04-10 08:56:09
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小猫三两只(金币+3,VIP+0):谢谢了,剩余的金币都给你吧.还想问你一些问题: 你所说的“该载体转化细菌，农杆菌用KANA筛选，但植物只能用潮霉素，如果你要用KANA筛的话，只可以找pBI系列的载体了”能否再解释一下，还不是太清楚。我还没找到这方面的资料。 另外，对于第二个载体，如果左边是启动筛选标记，右边是启动GUS，那若基因插到二者之间的MCS中，基因由谁来启动呢（因两个启动子都是朝外启动，并不会启动到MCS上的基因啊） 4-10 15:17
小猫三两只(金币+3,VIP+0):谢谢了,剩余的金币都给你吧.还想问你一些问题: 你所说的“该载体转化细菌，农杆菌用KANA筛选，但植物只能用潮霉素，如果你要用KANA筛的话，只可以找pBI系列的载体了”能否再解释一下，还不是太清楚。我还没找到这方面的资料。 另外，对于第二个载体，如果左边是启动筛选标记，右边是启动GUS，那若基因插到二者之间的MCS中，基因由谁来启动呢（因两个启动子都是朝外启动，并不会启动到MCS上的基因啊） 4-10 15:17
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对于第一个载体1391,是有两个35S,分别朝向不同的方向,向左的这个是用来启动潮霉素的,上边那个是在切点HindIII和BamHI之间,本身1391是用于检测你内源基因启动子的表达部位的,其后边接一个GUS基因,因而一般的使用方法是把上面的35S切掉了换自己的启动子，当然要转自己的基因也可以试着用上后面的EcoRI或者是再向右的GUS后面的酶切位点。该载体转化细菌，农杆菌用KANA筛选，但植物只能用潮霉素，如果你要用KANA筛的话，只可以找pBI系列的载体了。PWM101好像也可以，但我不是很清楚，你可去查一下。 对于第二个载体，也就是3301,我觉得左边这个35S是启动筛选标记的，多克隆位点是上面EcoRI到HindIII之间，可以用做互补载体的构建（自己感觉，加入大的TAC片段，或加自己启动子和基因什么的）右边的那个35S是启动GUS的，可以做为一个选择标记吧，如果用到NcoI和BglII应该可以检测启动子的表达pattern，同时我认为这个载体可以实现双基因共转化，就是前一个加在MCS区，后一个把GUS换掉就OK，当然本身这个载体的原始创意是什么也不是很清楚，你可以看一些相关的文章，应该会有解释。 对于你最后一个问题，我也只是个二把刀了，只是看他标的地方就好了（原本我以为是ori区开始算了，但看了下应该不是，都是从NcoI开始记的，不太清楚了） 等下面的高手解释 |
5楼2009-04-10 13:17:33
sutao1979
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解答如下：双元载体，PCAMBIA包括好多种，结构比较相似 第一个我就不说了 第二个问题：带箭头的黄色的35spromoter 一个是启动reporter gene的 就是gus 一个是启动selecttable marker的就是抗生素的基因，mcs多克隆位点就是插入目的片段的基因，黑色的箭头代表你插入的目的片段上连接的启动子在两个酶切位点之间 第三个问题：除了mcs有好多酶切位点之外，其他地方确实也有，是连接插入reportergene和selectable marker gene的两端的酶切位点，都可以用，要看看你将目的基因插入到哪里了，LB和RB之间的序列理论上都可以，但是，酶切的时候最好找酶切之后只有一个缺口的位置，比如HindIII和BamHI,这样可以给你省很多麻烦 |
6楼2009-04-10 16:27:19
7楼2009-04-10 17:39:29