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在重组蛋白纯化中获得可溶性蛋白的三个关键参数 已有2人参与
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蛋白质的聚集是蛋白质产生过程中的一个瓶颈，改善蛋白质的可溶性，不仅可以明显加速生物制品和酶类的生产，而且有助于进行后期更多的深入研究。在重组蛋白纯化中获得可溶性天然蛋白质的三个关键参数主要有IPTG浓度、温度和诱导时间。 目前常规的重组蛋白纯化策略对于可溶性蛋白的分析、纯化和制备均具有较高的成功率。目的蛋白质需要进一步纯化需要根据蛋白质的用途确定，纯化的目标蛋白质的保存条件需要根据蛋白质的性质和用途确定。美迪西生物医药提供重组蛋白表达服务，其在重组蛋白表达与纯化服务方面经验丰富，拥有多种蛋白表达系统，包括原核蛋白表达系统、酵母蛋白表达系统、昆虫细胞蛋白表达系统（杆状病毒）哺乳动物细胞蛋白表达系统，具备多种融合技术，可以为客户在蛋白表达与纯化方面提供多种选择。 在重组蛋白纯化和分离后，需要把纯化过程中引入的有害离子除去，或者更换缓冲液，常用的办法是透析。透析即把蛋白质溶液装入透析袋内，用需要的缓冲液进行透析，并不断的更换缓冲液，因透析所需时间较长，所以最好在低温中进行。 1、IPTG浓度 IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)是β-半乳糖苷酶底物的类似物，具有极强的诱导性，在IPTG诱导下，诱导物可与阻遏蛋白形成复合物，使阻遏蛋白构象发生改变，从而不能与目的基因结合，进而使目的基因高效表达。异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）的作用与异乳糖相同，是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用。经过实验会发现，IPTG的浓度并不是越大越好。这是由于IPTG对菌体具有一定的毒性，超过浓度也会杀死细胞；而且一般来讲，细胞内表达的可溶性蛋白越多越好，但是很多时侯IPTG浓度太高会形成大量包涵体，而可溶性蛋白的量反而减少。因此，最合适的IPTG浓度往往不是越大越好，反而浓度较低。 对基因工程菌株进行诱导培养目的在于提高目的蛋白的产量，降低成本。目的基因的表达量除受菌株自身因素和表达质粒的影响外，还受其他外界条件，如诱导物浓度、诱导温度和诱导时间等的影响。所以一般情况下，一个未知的蛋白在表达纯化之前，最好要对诱导时间，温度以及IPTG浓度进行研究，以便选择合适的条件，获得最好的实验结果。 2、诱导温度 降低培养温度是减少细胞内重组蛋白聚集的一个好方法，它适用于表达大量不同的蛋白质，降低温度可以放慢细胞内蛋白表达速率。偶尔可以在37°C的典型温度下，通过生长和诱导分离可溶性形式的蛋白质，但通常情况下，溶解度在较低温度下增强。可尝试在30°C，25°C和18°C下进行诱导。注意如果首先在37℃生长，先让培养物冷却到诱导温度，再加入IPTG。 3、诱导时间 诱导时间和诱导剂的用量也是控制可溶性外源蛋白表达的重要因素，诱导时间更长并不总是更好。摇瓶培养时，应选用低菌体浓度诱导，因为在低菌浓度下菌体处于对数生长期，生长活跃，有利于表达可溶性蛋白。然而，如果能保证合理的补料与充分的通气，在较高菌浓度下诱导也同样可能获得可溶蛋白的高效表达。在某些情况下，诱导剂的流加能显著提高可溶蛋白的表达水平。 对于对宿主有毒的蛋白尤其如此。在诱导期间，每隔几个小时取样，并检查目的蛋白的表达。典型的诱导时间根据温度而变化：对于37℃，尝试4小时；对于30℃，进行5-6小时，并且任何低于25℃的温度应该允许生长过夜。 将目的蛋白的编码序列克隆到具有不同标记（例如六组氨酸、谷胱甘肽-S-转移酶（GST），麦芽糖结合蛋白（MBP））的2-3个载体中。然后选择三种不同的诱导时间和温度以及几种IPTG浓度，进行小规模预实验。诱导后，分析每个样本中的（1）未诱导样本；（2）在不同时间点的诱导样本；（3）裂解物；（4）可溶性片段。 |
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