| 查看: 3269 | 回复: 31 | ||
| 【奖励】 本帖被评价12次，作者zhaolixia0814增加金币 8.75 个 | ||
| 当前主题已经存档。 | ||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | ||
[资源]
[原创] 半年载体构建中连接的心得, 欢迎大家一起切磋交流
|
||
|
去年做了半年载体构建，连接无疑是其中重要的一关，根据自己的实验心得和已有资料做个总结，希望对大家有用，同时希望战友们批评指正！互相进步！ 首先说说2片段连接 通常是指目的片断和载体片断的连接，包括①小片段（目的片断小于载体片断的大小）和载体片段的连接，这种情况多些，也比较容易连接，按照说明书要求的比例进行即可，比如TAKARA的pMD19-T Simple Vector连接时Vector DNA和Insert DNA的摩尔比一般为1 ：2～10即可，如果效果不佳，检测一下感受态细胞，如果片断过小比如几十bp，连接时要加大小片段的摩尔数，多连几管，挑选白斑，以上是指双酶切后的连接，即载体和目的片断俩端的酶切位点相同；②大片段（目的片断与载体片断的大小差不多甚至大于载体的大小）和载体片段的连接，目的片断与载体片断的大小差不多的情况应尽量避免，因为这会给目的片断胶回收带来麻烦，我就遇到过这种情况，胶回收时很是费尽，最后勉强分开，当然换个载体也许就解决问题了。我做过3000多bp和pMD19-T Simple Vector的连接，开始不行，后来成功了，连接率不高，我的经验是如果感受态细胞没问题，那就反复试目的片断和载体片断的连接比例，可以超出此范围1 ：2～10一试。 再说说多片断的连接 做多个片断的连接，首先强调一个问题，那就是大家一定要注意所有片断俩端的酶，把他们的特征要弄得清清楚楚，是否存在同尾酶和同裂酶，多片段同时连接时这个问题就太重要了；多片段连接要总体先规划好了，再开始入手设计引物，否则考虑不周后患无穷啊,呵呵！ ①多片断的连接最经常的做法是顺次俩俩连接（目的片断和载体片断的连接），就采用载体上的多克隆位点，注意顺序！如果所选载体多克隆位点上的俩个酶切位点比较近，甚至相邻，最好分步酶切载体，比双酶切效果好的多，经验！接下来的方法和前面的差不多，就是麻烦些 ②多片断的同时连接，我最多做过四个片断的同时的连接，当然，其中包括载体片断。做多个片断的同时连接，不得不把我走过的弯路告诉大家！那就是同尾酶的问题，我也是在合成引物后发现的这个问题，我的其中一个片断俩端分别是XhoI和SalI，结果问题来了，酶切后连接时有可能正连也可能反向连接，如果连正了还好，反了就比较郁闷了，根据当时的实验设计，如果想改就得改所有其他片段的引物，硬着头皮来吧！筛吧！一个原则，小片段要量大，多设计几种比例，连吧，挑选白斑，做菌落PCR检测连接情况，想想觉得痛苦，每个板挑几十个白斑做鉴定，大部分假阳性，不过最后还是找到了正确连接的克隆，可是浪费了很多时间和金钱，惨痛的教训！感觉多片断的连接，关键还是片断之间的摩尔比，大胆尝试吧！ 需要说明的一点，以上主要是针对粘性末端的连接，关于平端连接，我做的比较少，欢迎其他同学总结！ |
回复此楼» 猜你喜欢
急需调剂
已经有9人回复
-
申博/考博
已经有4人回复
-
化工学硕294分，求导师收留
已经有37人回复
-
求调剂
已经有11人回复
-
260求调剂
已经有4人回复
-
一志愿华中农业071010，320求调剂
已经有19人回复
-
304求调剂
已经有7人回复
-
求博导｜生物质基多孔碳/超级电容方向，已有相关成果，寻能源材料/碳材料方向老师
已经有3人回复
-
二苯甲酮酸类衍生物
已经有6人回复
-
接受任何调剂
已经有4人回复
30楼2009-10-14 16:35:17
2楼2009-04-06 22:32:53
3楼2009-04-07 08:37:16
4楼2009-04-07 12:10:32
20