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酵母双杂交技术改进手段有哪些
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酵母双杂交技术作为研究蛋白质相互作用的主要方法，在规模化蛋白质相互作用研究中占据举足轻重的地位，已经成为分子生物学研究领域的重要实验手段，因此有不少生物公司提供从构建杂交文库到文库筛选的一站式酵母双杂交服务。但是酵母双杂交技术的分子生物学操作是比较复杂的，包含从基因的载体构建、蛋白质的自激活检测到多次酵母转化和相互作用的确认，对酵母双杂交技术进行改进，可以提高其工作效率。 目前市场上提供的酵母双杂交服务有核体系和膜体系两种，酵母双杂交与其他相互作用筛选手段相比，最大的优势在于它能够适应基因组水平的高通量筛选。美迪西提供酵母双杂交服务，其具有独立优质的实验室和专业的实验人员，提供详细的酵母双杂交实验步骤、原始数据和图片、结果分析，可以出具权威检测数据报告。 为了降低工作量使其更适用于高通量筛选，需要对酵母双杂交技术进行改进，常采用的手段有酵母双杂交阵列筛选技术和规模化载体构建方法。 1、酵母双杂交阵列筛选技术 从传统的酵母双杂交技术基础上发展而来的酵母双杂交文库筛选技术能够支持一个诱饵与整个cDNA文库的筛选，可以用于筛选一个蛋白质与整个cDNA文库中的相互作用。但是该技术并不适用于基因组水平的相互作用筛选。 首先，基因组水平的相互作用筛选需要成千上万的诱饵，而对这些诱饵进行文库筛选工作量极大；其次，由于cDNA片段不同，筛选过程中呈劣势生长的菌株不容易得到筛选；最后筛库同样面临单次筛选只能获得文库中极少部分的相互作用结果。为了适应基因组水平的相互作用筛选，人们开发了酵母双杂交阵列筛选技术。 阵列筛选法又可分为一对一阵列、高通量阵列法、亚库对亚库法。一对一阵列法含有不同BD-X 的菌株和所有含不同 AD-Y的菌株一一对应筛选。 高通量阵列法是把所有不同 ORF-AD 集合成库，然后与排成阵列的不同 BD-X 作用的筛选方法，其实质是诱饵数量较大情况下的阵列化文库筛选。亚库对亚库法把总数较大的 DBD-X 和 AD-Y 的成员分别编号并分组，每组含一定数量的成员，然后集合每组成员形成亚库(pool)，再用猎物亚库对诱饵亚库一一作用，筛选阳性克隆。此法工作量大，获得的阳性克隆的猎物和诱饵都需测序鉴定。 2、规模化载体构建方法 规模化酵母双杂交筛选需要构建大量的表达载体，因此载体构建工作的质量和速度对于后续的酵母双杂交筛选至关重要。传统的构建载体的方法是限制酶切-连接方法，可以有效地将目的片段插入载体，然而其操作时间长，需要酶切、连接两步反应，构建成功后的重组质粒需要进行DNA测序来验证其正确性，表达载体的构建过程中存在载体自连、连接困难等缺点，这些缺点使得限制酶切-连接方法不能用于高通量的载体构建。 基因克隆是分子生物学中的一种基本的操作方法，通过双酶切来构建载体是其中常用的一种方法，这种方法利用限制性内切酶可以识别并切割特定的核苷酸的原理，用两种不同的限制性内切酶切割靶基因得到前后都带有粘性末端的靶基因片段，与同样经两种限制性内切酶切割得到的带有相同粘性末端的线性载体在T4DNA连接酶作用下进行连接，从而实现基因克隆酶切效率及连接效率不高等问题，致使靶基因片段插入载体相当困难，为此人们采取了多种策略进行克隆。后来开发了一种叫做同源重组的基因克隆方法。 相比之下，同源重组方法构建载体操作相对简单易行。相比双酶切载体构建方法，该方法的构建过程有些不同。首先，靶基因片段扩增引物有别于常规引物设计；其次，载体切割过程中只需要进行单酶切；第三，载体和目的基因片段的连接是基于同源重组而不是粘性末端互补。在实际操作过程中，双酶切方法和同源重组方法各有优势。同源重组方法构建载体中最有代表性的是Gateway方法。 Gateway利用了位点特异重组，所以在构建入门载体后，不再需要使用限制性内切酶和连接酶。一旦拥有了一个入门克隆，就可以多次使用它，转移目的基因到Gateway改造过的各种表达载体（目的载体）。此外，由于在重组时DNA片段的阅读框和方向保持不变，因而不必再为新的表达克隆测序担心。在使用每一种新的表达系统时，将会节省更多的时间。 Gateway技术是克隆和亚克隆DNA序列的一项新颖的通用系统，便于功能基因的分析和蛋白质的表达。一旦进入这个多功能的操作系统，DNA片段可以通过位点特异的重组在载体之间转移。 Gateway技术是基于已研究的非常清楚的λ噬菌体位点特异重组系统（attB x attP →attL x attR）。BP和LR两个反应就构成了Gateway技术。BP反应是利用一个attB DNA片段或表达克隆和一个attP供体载体之间的重组反应，创建一个入门克隆。LR反应是一个attL入门克隆和一个attR目的载体之间的重组反应。LR反应用来在平行的反应中转移目的序列到一个或更多个目的载体。 在BP反应中基因转移形成入门克隆，在LR反应中入门克隆可以作为反应物产生最终的表达克隆。完成构建Gateway表达克隆仅需两步： （1）创建入门克隆，通过PCR或传统的克隆方法将目的基因克隆进入门载体。 （2）混合包含目的基因的入门克隆和合适的目的载体以及Gateway LR Clonase酶，构建表达克隆。（表达克隆用来在合适的宿主中进行蛋白的表达和分析。） 酵母双杂交技术以其简便、灵敏、高效以及能够反映不同蛋白质之间在活细胞内的相互作用等特点，对其技术进行改进，将使其在蛋白互作的研究中得到更为广泛的应用。 |
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