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medicilon

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[交流] 盘点常用的免疫组化染色方法已有1人参与

免疫组化是将免疫学与分子生物学技术同病理形态学方法相结合所形成的一门新兴学科，免疫组化染色是医学和生命科学研究中经常要使用的研究方法，因此不少医药研发公司提供免疫组化染色服务。免疫组化染色的基本原理是利用抗原与抗体的特异性反应，在细胞或组织中定位抗原或抗体，广泛应用于肿瘤病理诊断和神经解剖学。
一张良好的免疫组化染色片是正确判断染色结果的基础和前提，但是免疫组化染色步骤繁琐而且每一步都可能影响染色的最终结果，故保证染色质量是贯穿于免疫组化试验过程的核心。美迪西是一家临床前CRO公司，提供免疫组化染色服务。对于免疫组化来说，常用的染色方法有直接法、间接法、酶桥法、过氧化物酶－过氧化物酶复合物法、SP法免疫组化染色法和卵白素－生物素－过氧化物酶复合物法等。
1、直接法
用酶标记的特异性抗体直接与标本中的相应抗原反应结合，再与酶的底物作用产生有色的产物，沉积在抗原－抗体反应的部位。该方法的优点是简单、步骤少、省时、特异性强、非特异染色较轻，但是敏感性差。
2、间接法
先用未标记的特异性抗体（一抗）与标本中的相应抗原反应，再用抗特异性抗体的酶标记抗体与结合在抗原上的一抗反应。该方法简便、敏感性较直接法高，但是不足的是非特异染色较多。
3、酶桥法
用化学交联法将酶与抗体分子连接，染色时在特异性抗体与标本中抗原结合之后，用桥抗体结合于其上，再将抗酶抗体结合于桥抗体上，最后把酶结合在酶抗体上，经过底物的呈色反应而将抗原显示出来。
优点：提高了方法的敏感性，非特异染色较轻。
缺点：抗酶抗体必须是高效价、经过高度纯化，否则将降低敏感性。
4、过氧化物酶－过氧化物酶复合物法（PAP法）
PAP法的基本原理与酶桥法相同，只是用酶和抗体制成的免疫复合物（PAP）代替了酶桥法中的抗酶抗体和随后结合的酶，把两个步骤合并为一个步骤。
优点：敏感性比间接法高20倍。
缺点：理论上PAP是一种复合物，因其不是抗HRP抗体，不能与HRP结合，不会造成背景染色，但在实际工作中仍存在比较重的非特异性背景染色。
5、SP法免疫组化染色
链霉素抗生物素蛋白（SA）是从链霉素中分离出的蛋白质，穿透组织的能力比ABC、PAP复合物大，反应速度快，它含有四个亚基，每个亚基都有与生物素（Biotin）连接的部位，且二者间有极强的亲和力，SA的等电位接近于6.5，近中性，而卵白素（Avidin）为10，因此，SA几乎不与组织中的内源性凝集样物质发生非特异性结合，使用链霉素抗生物素蛋白－过氧化物酶放大系统，即可产生低背景、高放大效果。S－P采用生物素标记的第二抗体与链霉素抗生物素蛋白连接的过氧化物酶及基质素混合液来测定细胞和组织中的抗原。
6、卵白素－生物素－过氧化物酶复合物法
本方法是利用卵白素与生物素特有的高度亲和力这一生物学特性，先将生物素与酶结合，形成生物素化HRP，以生物素化HRP与卵白素按一定比例混合，形成一个复合物。具体步骤是：特异性抗体与组织中抗原结合形成抗原抗体复合物。生物素化二抗再与特异性抗体反应，然后加入ABC复合物，形成抗原＋特异性抗体＋生物素化二抗＋卵白素＋生物素＋HRP复合物，最后DAB显色。
免疫组化染色方法选择的原则
要根据需要证明的抗原的种类，标本中的抗原保存情况，实验的精度要求和实验室的条件来选择最佳的方法。简单来说，就是五个“S”。
（1）首先是“Specificity”，即特异性。例如，要证明组织中的细胞角蛋白以区分来源于上皮的癌和来源于间叶组织的肉瘤，可选用多克隆的抗角蛋白抗体，其特异性较广；而要区分来源于鳞状上皮鳞癌和来源于腺上皮的腺癌，则应选用特异性更高的抗角蛋白不同家族成份的单克隆抗体。
　　特异性的计算方法为：特异性=观察的阴性结果数/预期的阴性结果数×%
（2）其次是“Sensitivity”，即敏感性。敏感性高，则特异性下降，假阳性增加；反之，敏感性低，则特异性升高，假阴性升高。
　　计算方法如下：敏感性=观察的阳性结果数/预期的阳性结果数×%
（3）第三是“Simplicity”，简便性。在达到要求的前提下，越简单的方法，越能节约时间和经费。如能用PAP法就不要用ABPAP法。
（4）第四是“Safely”，安全性。免疫组化操作要使用DAB、酸、碱、二甲苯、过氧化氢等有害物质。不仅对操作者有一定的危害，对环境也有一定的污染。在选用方法时，如果条件允许，应尽量用对人体危害小的方法，如用AP标记抗体。
（5）第五是“Save of time and money”，即省时省钱。实际上与第二条简便性相似，简单的方法一般省时省钱。
　　总之，在方法的选择上，最为重要的是特异性。其它的条件要在满足特异性后才考虑。由于免疫组化染色过程中仍存在很多的步骤和环节，影响因素众多，直接或间接地影响了最终的结果。当免疫组化染色没有出现预期的效果时，应系统地分析和查找原因，以便找到有效的解决办法，使试验结果更加可靠。

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