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小小小胖子

新虫 (初入文坛)

[交流] 求助基因敲除--融合PCR之同源臂融合相关问题 已有7人参与

左臂片段aacgtttctgctgggacagttgttgtttggttttctagaatcttttgagaaagttgagcctgagttaccactacttctaggccttttgctaaagcttcttgttgtcttttttctccttgctctattccctctaacagagatttagaagcagaaatagaggtttgcaaatctttacgaagcttttgaacttcagcaccaatttcttcatttttagtttcatttagaatggaatcaatagatgataatgtatccgatgctgtattaagctgttgctgagcttttgtatcgttaagcgtaataagcacatctcctttttctacgctatcgcctactttaacatgaactttttccacaggaagggggagagatgttacaataggagcctgtttggcaggcttagctatgcctgatagctccattagccctgatatatcttgttcttttactttggctgtttgaatggggatggctgttttctcagtattatccgttgtaatttcttttggagcacaagcagctaaagtaagaatactggttattaaccataacttacgcatatgttcaccgccttgatgagtttatgtagtatctcttcataaataaatgaactcatatttaacgtgcgctctttttcaacttttataacgaaaagggaggaatattccttcagataagccaaattttacaggataacttcctttttaagaaaagaaaaataatttgttcaaaaagttgtcacgaatatttatcaagaacatgaaaccccttatgacgtttattcgtatattaggtgtggtaaaaaaaaagggaagcacaagaaaaattcgaaaaagtataccattaaggtcagatttgttgtataatactgatagagattctcaatttaaacttattttaaattagtatctattttaaataagtattatacaaactatgctatttttagtatacaaaaaagaaccgcttccatcatgtttgaagtgtttatgattttattccaa
右臂片段gaaacatatttctttctataaaaaaagtggcttaacaataagttaagccactttttttcgatttgtctttttttgattgacaataaatccaattgcaacgacaaatataacaagcagtgttggaacaatgtagagagttgacgaggagtgaaagaaaaaagcaagcttttcttcgtgggtgatcattttacctgctgtaaacgcaaggataccagaaccaacgtatacaagaaaagaaaattgctccatcaagtaaagaactattttgcttccccagacaataattggaactgaaacaagcaagccaatgacaacaaatgttaagtttccgtgtgcagctccagcgacagctagtacgttatcaagacccattacaatgtccgcaaaaacaatcgttttgatggccgcaaaaatggacacactagccttaatatgttgttgttcttcttcttggatcagtagcttaatggcaatgcttatgagcaaaataccaccagcgaactgtaaataagggatcgtaagcaaatagacagcaaccattgtcagaagaatgcgtactataatggcaaggcctgtaccaagtacaatcgctttattacgctgattttctggtaagttgcggcaagcaagagcaataacaatggcattatcgcctccaagtacaatgtcaatgccgataatcattaaaataatggtgagcgcttcaagttccaatttgacatcctcccatcttcattacctaaatatattcaaaaaagtctcaagcttgtctgttattttttaattgaagaaaaaaagtgatatgagagtcttctcaaacattttattttctttctgaggtattttgtcatacaatgaagatataatttaccgtagtaatgaatatctacagtgagagcagaagtttttagtaccgaagtcttccacttctattcaaagtcctttttgggaaactaatgttaagatttaaaaagggagagaggaagaaactttacgaaatcgtcgaacggcaggcgtgcaaacttggcgtaatcatggtcatagctgtttcc
求助各位大神,本人女研究生一枚,第一次做这方面的试验,我已将设计了好几对引物,均融合不上,我想把左臂和右臂融合起来,左F需要带酶切位点kpn I;左R需要带酶切位点bam HI,右F需要带酶切位点bam HI;右R左F需要带酶切位点kpn I。求大神帮忙设计引物以及左臂和右臂融合的pcr具体体系以及条件,小女子就此谢过
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Vet is king

新虫 (文坛精英)

2楼2018-09-04 19:03:10
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balalalabala

新虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
多片段同源重组试剂盒,不嫌麻烦也可以试试酶切连接的方法

发自小木虫Android客户端
3楼2018-09-04 19:53:50
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soarrow

铁杆木虫 (正式写手)

酱油歪楼党

★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
渊博震天: 金币+2, 鼓励回帖交流 2018-09-05 07:50:44
在做同样的东东,,,
以前测试过overlap PCR效果不是很稳定,时灵时不灵,,,现在都改用无缝链接的方式,就是楼上提到的多片段同源重组试剂盒,
基本一把就出来。
4楼2018-09-05 01:41:06
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zw破风

金虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
之前引物是怎么设计的?
5楼2018-09-05 09:39:50
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小小小胖子

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by soarrow at 2018-09-05 01:41:06
在做同样的东东,,,
以前测试过overlap PCR效果不是很稳定,时灵时不灵,,,现在都改用无缝链接的方式,就是楼上提到的多片段同源重组试剂盒,
基本一把就出来。

谢谢您呀
6楼2018-09-05 09:57:29
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小小小胖子

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
5楼: Originally posted by zw破风 at 2018-09-05 09:39:50
之前引物是怎么设计的?

左F为正常设计引物,左R为右臂上游引物的反向互补序列
右F为左臂末端碱基(大概20bp)加上右臂前段碱基(大概20bp),右R为正常设计引物
我反复设计了好几次引物 单独片段能p出来 但是就是融合不上
7楼2018-09-05 10:02:55
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白话八股

金虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
同意楼上的,overlap的方法有时候不行,多片段无缝克隆

发自小木虫Android客户端
最爱的那个人会出现在身边。
8楼2018-09-05 11:25:53
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20081118129

新虫 (著名写手)

Drake


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
4楼: Originally posted by soarrow at 2018-09-05 01:41:06
在做同样的东东,,,
以前测试过overlap PCR效果不是很稳定,时灵时不灵,,,现在都改用无缝链接的方式,就是楼上提到的多片段同源重组试剂盒,
基本一把就出来。

你好!我也是在做同源重组,就是做不出来。我是要删除基因,用抗性基因去替换,你看看有什么技巧,向你请教。

发自小木虫IOS客户端
9楼2018-09-05 14:46:17
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soarrow

铁杆木虫 (正式写手)

酱油歪楼党


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
9楼: Originally posted by 20081118129 at 2018-09-05 14:46:17
你好!我也是在做同源重组,就是做不出来。我是要删除基因,用抗性基因去替换,你看看有什么技巧,向你请教。
...

你是卡在哪个步骤?
一般流程也就载体构建--转化--筛选--鉴定这几个步骤。

另外就是要看你实验对象是真核/原核?对应使用的是什么菌株/细胞株?
10楼2018-09-05 23:29:13
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