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浅析酵母表达系统的三种质粒载体 已有1人参与
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原核表达系统中的大肠杆菌因为遗传背景清楚、易于培养、生长周期短、对许多蛋白质有很强的耐受能力等优点而得到广泛应用。然而人类蛋白质在原核生物中的表达是具有局限性的，有些蛋白质必须经过翻译后修饰，如糖基化、特定位点切割等才能具有完全的生物活性，这时候最好选用真核细胞作为宿主。酵母表达系统，如毕赤酵母近年来越来越多的大分子蛋白在该表达体系中得到高效、稳定表达。毕赤酵母蛋白产物糖基化简单，产物直接以可溶性、天然性形式分泌到胞外。该系统具有高表达、高稳定、高分泌的特点，非常适合于基因工程高密度的发酵培养。 有些蛋白质必须在高等真核哺乳动物细胞系统中制备，但是哺乳动物系统很昂贵，并且可能产生非常低的产量。因此使用低等真核生物——酵母表达系统，如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）和甲基化酵母如毕赤酵母（Pichia pastoris）和甲醇毕赤酵母（Pichia methanolica）的替代系统已变得重要。这些系统不以与人糖基化相同的方式糖基化。例如，酿酒酵母产生高甘露糖结构，并且可用于产生适当折叠的活性和可溶性多亚基蛋白质。作为一家临床前CRO公司，美迪西在中国CRO公司排名中靠前，其科研人员建立了成熟的酵母表达纯化服务平台，提供优质的重组蛋白在毕赤酵母和酿酒酵母中的表达与纯化服务。 多年来，酵母系统一直是生产用于工业和生物制药的大量蛋白质的主要原料。酵母可以在明确定义的培养基中生长至非常高的细胞质量密度。酵母中的重组蛋白质可以过表达，因此产物从细胞中分泌出来并可用于在发酵溶液中回收。酵母分泌的蛋白质在共有糖基化位点处被高度糖基化。因此，历史上重组蛋白在酵母系统中的表达局限于蛋白质，其中翻译后的糖基化模式不影响蛋白质的功能。 如在任何原核生物中一样，酵母表达系统还需要复制或整合的起点，强启动子和选择标记。可以使用三种类型的载体进行重组蛋白在酿酒酵母中的表达：整合载体（YIp），附加型质粒（YEp）和着丝粒质粒（YCp）。 1、整合载体质粒 在生物学研究和基因工程应用中，会涉及将某个基因或某些基因插入到染色体中去的工作，承担这部分工作的载体，可称为整合载体。YIp整合载体是不自主复制但通过同源重组以低频率整合到基因组中的载体。通过同源重组整合环状质粒DNA导致载体序列的拷贝，其侧翼为酵母序列的两个直接拷贝。通常YIp向量作为单个拷贝整合。然而，已经开发了将多拷贝和稳定细胞系与高达15-20拷贝的重组基因整合的方法用于过表达特定基因。具有两个酵母区段的YIp质粒，例如YFG1和URA3标记；具有有可能整合到任一基因组位点，而含有重复DNA序列的载体，如Ty元件或rDNA，可以整合到基因组内的多个位点中的任何位点。 2、附加型载体质粒 附加型载体是一种允许和帮助水溶性物质渗入并穿过细胞膜的脂质层而转移到细胞中去的物质。酵母附加型载体质粒来源于野生型的酵母质粒，这种质粒存在于很多啤酒酵母株系中。该质粒被一段长度约为599bp的反向重复序列分为两个部分，每一个部分都含有一个启动子和该启动子控制下的两个基因。其中一个基因为FLP，它编码一个位点特异性的重组酶，这个酶可以催化反向重复序列之间的遗传重组。 YEp酵母附加型质粒载体自主复制，因为存在作为复制起点（2μmori）的酵母2μm质粒片段。2μm的ori负责YEp载体的高拷贝数和高频率的转化。大多数YEp质粒相对不稳定，甚至在选择性生长条件下，只有60-95％的细胞保留YEp质粒。大多数YEp质粒的拷贝数范围为每个细胞10至40个拷贝。虽然该系统用于小规模表达研究，但是不建议在大规模生产中使用YEp载体。 3、酵母着丝粒质粒载体 酵母着丝粒质粒载体是自主复制的含有着丝粒序列（CEN）和自主复制序列（ARS）的载体。YCp载体通常以非常低的拷贝数存在，每个细胞1至3个。这些载体也相对不稳定并且在高水平表达中不是非常有用，但是用作常规克隆载体（例如，pYC2，pBM272）。含有着丝粒质粒的酵母细胞生长十分缓慢，而且细胞的生存能力下降。 酵母选择标记可以分为两种类型：互补标记和显性选择标记。显性选择标记是可用于酵母的抗生素标记，例如G418和环己酰胺。互补标记是标记基因，其补充基因组中的营养缺陷型突变，如URA3，TRPI，HIS3和LEU2。这些营养缺陷型标记用于选择具有所有三种类型表达系统（整合，附加型和着丝粒质粒）的重组体。一系列酵母启动子可用于蛋白质表达，一些像ADH2，SUC2是可诱导的，而其他像GAPDH是组成型的表达。 |
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