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小木虫论坛-学术科研互动平台» 网络生活区» 有奖问答 » 有奖问答中转子版 » 【考马斯亮蓝测蛋白浓度问题】+【有效期至2009年04月14日】
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206206206206

新虫 (正式写手)

[交流] 【考马斯亮蓝测蛋白浓度问题】+【有效期至2009年04月14日】

在用考马斯亮蓝法测超氧化物歧化酶（SOD）的浓度出现问题：
比方说我称20mg的SOD，溶解于pH7.8  25mmol/L Tris-Hcl中然后取一定体积去测蛋白浓度，再通过标曲去计算SOD的重量，计算出来的数字是15-16mg左右，几乎每次都是这样。
重新配制过考马斯亮蓝，重新做标曲，但还是一样差不多就那么个结果！无法理解！
请各位朋友帮忙分析分析，谢谢！
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1楼 2009-04-04 15:52:32
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suifengpig

至尊木虫 (文坛精英)

猪猪家族之族长~~~

优秀版主
帮顶先！！！
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ㄗs：┏──────────┓╭╮│......努力學習......做一个有知识的流氓~~~~│╭╯┗──┰────┰──┛
2楼2009-04-04 17:57:01
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北斗星星

至尊木虫 (知名作家)

老版主
★ ★
206206206206(金币+2,VIP+0):谢谢支持！标准曲线的线性是符合要求的，比色杯用乙醇清洗过的，波长595，浓度不会是问题的，再高的都有。 4-4 23:49
用考马斯亮蓝法不同的蛋白质差异较大，而且标准曲线的线性一般不是太好，显色受时间和温度影响较大

该法染色能力极强，要特别注意比色杯的清洗，较高浓度的去污剂（trion .X-100, SDS）、尿素、和硫酸铵对测定有干扰

还有，你的测量波长是不是选的不合适？

还有，你配的溶液是不是浓度太大，未完全溶解，测量时取得是上清而使浓度偏小啊？

…… ……
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大步向前
3楼2009-04-04 21:36:25
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weiac

木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
206206206206(金币+8,VIP+0):谢谢你的分析！ 4-5 12:58
206206206206(金币+1,VIP+0):考马斯亮蓝是跟精氨酸和芳香族氨基酸结合产生颜色变化吗？我没找到这方面的资料，你有吗？谢谢！ 4-5 13:04
可能的原因分析：
1.由于不同种类的蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此考马斯亮蓝法用于测定与标准曲线蛋白不同的蛋白质时有较大的偏差。因此，在制作标准曲线时，只有采用与待测蛋白同一类的标准蛋白，才会消除这方面的误差；如果不能没有同类的标准蛋白，有条件的话可以通过试验求出校正因子，测得的结果要乘上校正因子。如果没有条件进行校正，那就只能任凭其有较大的误差了，这也就是考马斯亮蓝法的主要缺点。
2. 你配20mg的SOD，测得结果15~16mg，是不是有可能你的SOD本身就不纯，还有就是因为为什么原因吸潮了。称20mg但实际的SOD没有那么多。
3.考马斯亮蓝法要求样品浓度最高不能超过0.1mg/mL, 0~0.1mg/mL是其可用范围，而且浓度越高，误差越大。
4. 蛋白质溶液不是真正的溶液，而是蛋白分散到水中形成的胶体（因为蛋白是大分子），实际上是不符合郎白比尔定律的，标准曲线实际上是不可能是严格的直线或线段。所以一般要求是不能用标准曲线拟合方程来计算测定结果的，而应该采用作垂线和平行线的方法来得到结果。
5.考马斯亮蓝法颜色在5~20分钟比较稳定，但也不是绝对的，所呈色反应之后的测定时间要尽量一致。
6.其他干扰因素。表面活性剂（洗涤剂类）、碱性pH、楼上分析的因素等。
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4楼2009-04-05 06:01:08
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weiac

木虫 (著名写手)
★
206206206206(金币+1,VIP+0):由于不同种类的蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此考马斯亮蓝法用于测定与标准曲线蛋白不同的蛋白质时有较大的偏差。估计是这个原因吧，其他几点我以前也知道，都尽力去减少过这些方面的误差！ 4-5 13:02
分光光度计测定时吸光度的读数要控制在0.7以下。
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5楼2009-04-05 06:06:42
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xuhengking

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
206206206206(金币+3,VIP+0):谢谢你！我的邮箱是zhjk510@163.com 4-5 12:45
为楼主查找了这方面的三篇文献，但是我的网络受限无法上传，请楼主告知邮箱，我给发过去，希望能对你的实验有帮助
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6楼2009-04-05 09:15:25
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xuhengking

金虫 (正式写手)
链接地址：http://g.zhubajie.com/urllink.php?id=46779456by4tw6coefnpqjm
http://g.zhubajie.com/urllink.php?id=4677948gqna590kn1kuh1mt
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7楼2009-04-05 11:37:18
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206206206206

新虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by weiac at 2009-4-5 06:01:
可能的原因分析：
1.由于不同种类的蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此考马斯亮蓝法用于测定与标准曲线蛋白不同的蛋白质时有较大的偏差。因此，在制作标准曲线时，只有采用与待测蛋白同一类的标准蛋 ...

不同种类的蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此考马斯亮蓝法用于测定与标准曲线蛋白不同的蛋白质时有较大的偏差？
考马斯亮蓝是跟精氨酸和芳香族氨基酸结合产生颜色变化？
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8楼2009-04-05 13:04:04
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robot551

金虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★
206206206206(金币+5,VIP+0):用SOD做标准曲线，想法是挺好的哦，不过我的SOD不是纯的，不适合啊！ 4-8 09:14
引用回帖:
Originally posted by 206206206206 at 2009-4-5 13:04:

不同种类的蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此考马斯亮蓝法用于测定与标准曲线蛋白不同的蛋白质时有较大的偏差？
考马斯亮蓝是跟精氨酸和芳香族氨基酸结合产生颜色变化？

楼主MM，你的蛋白标线是用牛血清蛋白（BSA）做的吧？你要测定的是SOD。的确，考法测定的蛋白含量主要跟精氨酸和芳香族氨基酸有关，ls几位分析的对，这在教科书中能找到依据的！
解决的办法：你干脆用你的SOD做标准曲线，得到 “吸光度－SOD浓度”曲线，而不是“吸光度－BSA浓度”，这这样就不会出现你说的哪种问题了。

[ Last edited by robot551 on 2009-4-5 at 16:41 ]
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我们微笑，想念，咫尺天涯……
9楼2009-04-05 16:26:38
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robot551

金虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★
206206206206(金币+5,VIP+0):谢谢你的帮忙！ 4-8 09:11
给你找到了建立考马斯亮蓝法最原始的文献－1976年
考马斯亮蓝法测蛋白质d的建立1976－BradfordAnalBioc.pdf
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我们微笑，想念，咫尺天涯……
10楼2009-04-05 16:44:20
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