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新虫 (初入文坛)

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[交流] 乳酸菌感受态的制备方法及其电转条件已有3人参与

乳酸菌有植物乳杆菌，乳酸乳球菌，唾液乳杆菌，等等，每一个乳酸菌感受态的制备方法都有不同，同一种乳酸菌，比如植物乳酸菌也有好多种报道的制备方法！

因为是乳酸菌感受态制备方面的小白，所以在此发帖问一下，大家都是用什么方法。我是用的植物乳杆菌和唾液乳杆菌这两种。之前找了两种方法来试着做，我是要做同源重组的，没有筛到阳性子，不知道是感受态没做好还是什么原因？

方法是：（所有操作冰上进行）

将-80 ℃低温冰箱保存的乳酸菌划线接种于 5 ml 新鲜的无抗 MRS 培养基中，于 37 ℃无菌厌氧的条件下培养过夜（15 h），挑取单菌落培养复苏，再按 1.0 %的接种量接种于 200 ml 新鲜的无抗 MRS 培养基中，形同条件下培养至其 OD600大约为 0.5 时停止培养，进行后续试验操作。

感受态制备

采用蔗糖溶液洗脱的方法制备乳酸菌感受态细胞，具体的制备过程如下：

⑴ 将培养至其 OD600为 0.4~06 的乳酸菌在 4 ℃，5 000 × g 的条件下离心 10 min，弃上清，收集菌体；

⑵ 用 20 ml 的无菌水清洗一次收集的菌体，并在 4 ℃，5 000 × g 的条件下离心 10min，弃上清，收集菌体；

⑶ 用 20 ml 的溶液Ⅰ（0.5 mol/L 蔗糖+10 %甘油）洗一次收集的菌体，并在 4 ℃，5 000 × g 的条件下离心 20 min，弃上清，收集菌体；

⑷ 用 20 ml 的溶液Ⅱ（0.5 mol/L 蔗糖+10 %甘油+0.05 mol/L 的 EDTA）洗一次, 收集的菌体，并在 4 ℃，5 000 × g 的条件下离心 20 min，弃上清，收集菌体；

⑸ 用 20 ml 的溶液Ⅰ重悬浮收集的菌体，室温静置 15 min，尽量增加乳酸菌细胞壁的通透性，随后在 4 ℃，5000 × g 的条件下离心 20 min，弃上清，收集菌体；

⑹ 用 20 ml 的溶液Ⅰ重悬浮收集的菌体，以尽量除去溶液Ⅱ中的 EDTA，4 ℃，5 000× g 的条件下离心 20 min，弃上清，收集菌体；

⑺ 用溶液Ⅰ重悬浮菌体，并用 200 μl 无菌离心管分装，100 μl/管，放置于-80 ℃低温冰箱保存备用。

电转前将质粒加到感受态中冰浴10min，然后转入预冷的电转杯中，进行电击

电转的程序用的BIO-red电转仪预制的程序

电转完成后，冰浴10min，在加预热的MRS进行复苏

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