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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 层析/纯化 » 新手求助，离子交换柱纯化蛋白，目标蛋白和杂蛋白吸附很少甚至没有挂住
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QQQQWwP

新虫 (初入文坛)

[求助] 新手求助，离子交换柱纯化蛋白，目标蛋白和杂蛋白吸附很少甚至没有挂住 已有4人参与

入门菜鸟，最近在纯化一个等电点8.5左右的蛋白。之前分别采用DEAE（缓冲液pH10）和CM（缓冲液pH7）进行纯化。
发现上样后蛋白质随throughout流出很多，阴离子交换柱洗脱时仅有少许蛋白洗出来，而阳离子交换柱甚至在洗脱时基本没有蛋白质（包括杂蛋白）。
我想是不是蛋白质的缓冲溶液离子强度太高的原因？
是否可以用稀释的办法？稀释的比例大概是怎么样的？
另听说可以在烧杯中放入填料进行简易的蛋白质吸附试验，有没有大神可以告知大概的步骤？

问题可能问的蠢，请大家见谅！

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1楼 2018-08-20 20:04:08
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QQQQWwP

新虫 (初入文坛)
补充一下，我用的破胞缓冲液、平衡缓冲液都是20mM Tris-HCl。

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2楼2018-08-20 20:14:58
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wx612725

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

现在做出来了吗，DEAE应该可以挂柱子啊
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破釜沉舟
3楼2019-12-12 12:35:21
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Cube生物

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

1、推荐使用高结合载量80mg/ml的填料，如：Cube 31101;
2、可能是孵育时间太短：需要降低上样量和上样流量；
3、可能是填料中沉积的杂质太多，导致填料结合能力下降：需要及时对填料进行清洗；
4、可能是目的蛋白和填料带相同电荷：更换填料或优化缓冲液；
5、可能是填料没平衡好，未完全解离：增加平衡柱体积数及优化缓冲液。
我们是德国库柏生物原装进口哈
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4楼2020-08-12 14:57:30
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雪色残洋

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

有可能是蛋白样品离子强度太高的问题，我也遇到挂不上柱的问题，后面经过蛋白样与缓冲液多次置换可以达到挂柱
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5楼2020-11-09 11:38:52
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masterHT

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

DEAE是弱阴离子填料，挂住能力随PH变化很大的，查找一下蛋白的最适pH,离等电点1个单位间隔尝试一下，比如7.0左右的buffer。不行的话就换强阴离子填料，这个pH对其结合影响不太大，工作pH范围还是挺广的。
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6楼2021-02-08 17:55:48
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