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合研生物

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[交流] 化合物筛选知多少

通过Lead Compound的发现途径，获得的化合物由于有效性与安全性等的考虑，一般不能直接作为药物应用于临床，需要经过一系列筛选验证。本期我们一起学习针对化合物活性筛选的主要方法。

   化合物活性筛选的方法，目前主要有虚拟药物筛选与实体药物筛选。

      1、虚拟药物筛选

      虚拟筛选(virtual screening，VS)也称计算机筛选，即在进行生物活性筛选之前，利用计算机上的分子对接软件模拟目标靶点与候选药物之间的相互作用，计算两者之间的亲和力大小，以降低实际筛选化合物数目，同时提高先导化合物发现效率。

      从原理上来讲，虚拟筛选可以分为两类，即基于受体的虚拟筛选和基于配体的虚拟筛选。

      基于受体的虚拟筛选从靶蛋白的三维结构出发，研究靶蛋白结合位点的特征性质以及它与小分子化合物之间的相互作用模式，根据与结合能相关的亲合性打分函数对蛋白和小分子化合物的结合能力进行评价，最终从大量的化合物分子中挑选出结合模式比较合理的、预测得分较高的化合物，用于后续的生物活性测试。

      基于配体的虚拟筛选一般是利用已知活性的小分子化合物，根据化合物的形状相似性或药效团模型在化合物数据库中搜索能够与它匹配的化学分子结构。最后对这些挑选出来的化合物进行实验筛选研究。

      虚拟筛选允许以快速和成本有效的方式评估大型化合物库和生物分子靶标之间的相互作用。

      除了计算筛选之外，还可以使用分子对接来研究小分子与靶点结合位点的结合模式。现有药物是一类生物利用度和相容性被验证的结构，故通过虚拟筛选发现的高效命中化合物在细胞或动物研究中失败的可能性会降低。此外，虚拟筛选使得学术团体或小公司不需要购买数千种化合物，能够对现有药物进行探索性重新定位，对抗新的疾病靶标。

      采用高通量虚拟筛选方法可从大型化合物库（如约20万个化合物的SPECS库，超过1亿个可购买化合物的ZINC库）中迅速筛选出有潜在活性的药物分子，该方法尽管在准确性方面还有待进一步提高，却已经在不少药物研发科学家的研究中有所使用并获得不错的效果。

      2、实体药物筛选

      顾名思义，就是在具体的实验基础上进行药物活性筛选。根据实验涉及的领域又可以分为2种，一种是基于分子生物学与细胞生物学方法的高通量筛选，一种是生物色谱联用技术。

高通量筛选(High throughput screening，HTS)

      技术是指以分子水平和细胞水平的实验方法为基础，以微板形式作为实验工具载体，以自动化操作系统执行试验过程，以灵敏快速的检测仪器采集实验结果数据，以计算机分析处理实验数据，在同一时间检测数以千万的样品，并以得到的相应数据库支持运转的技术体系，它具有微量、快速、灵敏和准确等特点。简言之就是可以通过一次实验获得大量的信息，并从中找到有价值的信息。

   常用的筛选模型都在分子水平和细胞水平，观察的是药物与分子靶点的相互作用，能够直接认识药物的基本作用机制。

   筛选模型：

   是指用于检测药物作用的实验方法。由于高通量筛选要求反应总体积小，而且，反应具有较高特异性和敏感性，因此对于筛选模型也要求较高，常用的筛选模型都在分子水平和细胞水平，观察的是药物与分子靶点的相互作用，能够直接认识药物的基本作用机制。目前这些模型主要集中在受体、酶、通道以及各种细胞反应方面。近年也出现了基因水平的药物筛选模型，使药物筛选模型的范围更为广泛。

分子水平的药物筛选模型

      受体筛选模型

      指受体与放射性配体结合模型。以受体为作用靶的筛选方法，包括检测功能反应、第二信使生成和标记配体与受体相互作用等不同类型。

      酶筛选模型

      观察药物对酶活性的影响。根据酶的特点,酶的反应底物，产物都可以作为检测指标，并由此确定反应速度。

      离子通道筛选模型

细胞水平药物筛选模型

      观察被筛样品对细胞的作用，但不能反映药物作用的具体途径和靶标，仅反映药物对细胞生长等过程的综合作用。包括：内皮细胞激活；细胞凋亡；抗肿瘤活性；转录调控检测；信号转导通路；细菌蛋白分泌;细菌生长。

   以酶为靶

   以酶为作用靶的高通量筛选方法，绝大多数是直接检测酶活性。具体方法根据酶的不同而不同，主要有基于放射性的方法和基于比色、荧光的方法两大类。

   以受体为靶

   以受体为作用靶的高通量筛选方法，包括检测功能反应、第二信使生成和标记配体与受体相互作用等不同类型。检测功能反应的优点是易于区分激动剂和拮抗剂。经典的功能检测方法通量低，而引入基于重组技术的报告基因检测方法极大地提高了筛选通量，既高效且节省成本。检测第二信使或下游机制如磷酸化，传统方法也比较麻烦，不适于高通量检测，但将这些机制与报告基因相偶联则能克服。

   以离子通道为靶

   Negri等建立了贝类动物毒素的高通量筛选方法。其作用靶为Na 通道上的蛤蚌毒素(STX)结合位点，用放射性配体(3H-STX)进行竞争性结合试验考察受试样品。Yong等用酵母双杂交的方法高通量筛选干扰N型钙通道β3亚单位与α1β亚单位相互作用的小分子，寻找新型钙通道拮抗剂。

      以核酸为靶

      Hamasaki等建立了以16S rRNA编码区结构和HIV-RRE RNA结构为靶的抑制剂的高通量筛选方法。寻找类似氨基糖甙类抗生素而亲和力更高或作用于相同核酸的其他位点的新化合物，以及不易被代谢失活的新化合物。方法基于当含芘的氨基甙类似物结合于RNA时，芘的荧光被淬灭的原理。在96孔板上，将芘碳酰巴龙霉素(PCP)，RNA结构配成溶液后加入有受试化合物的板孔中，用荧光读板器考察荧光恢复的程度。

      以细胞功能为基础

      1 内皮细胞激活

      内皮细胞激活是急慢性炎症过程中重要的组成环节。Rice等以Ｅ选择蛋白在细胞表面的表达作为标志，建立了内皮细胞激活抑制剂的高通量筛选方法。建立人脐静脉内皮细胞培养系统。IL-1刺激下，Ｅ选择蛋白在内皮细胞表面的表达用ELISA方法定量。方法包括细胞固定、加液、加受试化合物等操作，能保持细胞完整，不昂贵，可重复，筛选速度可达每星期1000种化合物。适用化合物范围很宽，并且方法用细胞作为检测对象，使能够较早地发现细胞对化合物的摄取及化合物的细胞毒性。

      2 细胞凋亡

      Erusalimsky等建立了新型细胞凋亡调节物的高通量筛选方法。细胞预先用3Ｈ胸苷标记，与凋亡诱导物孵育后，连续经过两种玻璃滤器。一个是中性的，捕获完整的染色质和高分子量ＤＮＡ。另一个装有DEAE活性基团，捕获低分子量DNA碎片。通过对滤器上放射性的测量，可以对DNA的破碎情况定量。

      3 抗肿瘤活性

      Lu等建立了用高通量“生物活性指纹”筛选抗肺癌药物的方法，考察受试分子(类维生素Ａ及类维生素Ａ相关分子)对许多不同细胞系的效应特点。检测指标包括：(1)肺癌细胞生长抑制检测。选择了约50种肿瘤和非肿瘤细胞，包括了大量不同的组织和(或)肿瘤来源。细胞暴露于受试化合物5ｄ后，用标准比色法测定存活细胞百分率。20%生长抑制率指示有活性。(2)集落形成抑制检测，用以区分细胞生长抑制作用和细胞杀伤作用。6孔板上加NCI-H292非小细胞肺癌细胞，暴露于受试物一定时间。然后对细胞进行清洗，植于无受试物的培养介质共7d。用结晶紫对细胞染色，考察集落形成情况。(3)凋亡检测，用ELISA方法测量细胞DNA破碎。(4)转录调控检测，用以考察受试化合物是否有类维生素Ａ受体介导的转录抑制作用。方法是将HeLa TK-细胞用73Col-CAT报告基因连同受体的表达载体转染，与受试物一起培养，用ELISA方法检测CAT活性。

      4 细胞转导通路

      Su等建立了TGFβ3通路作用物的高通量筛选方法。构建融合报告基因，转染细胞，选择虫荧光素酶表达能被TGFβ高诱导的克隆。将细胞植于96孔板，与受试化合物孵育后，稀释并加入Steady-Glo底物测虫荧光素酶活力，与对照比较，计算相对酶活性增加值。

   5 细菌蛋白分泌

   Alksne等建立了以抑制细菌蛋白分泌为作用方式的新型抗生素的高通量筛选方法。该方法基于SecA-lacZ融合报告基因。SecA是一种自我调控翻译的蛋白，当细菌蛋白分泌被干扰时，该报告基因被诱导。

   6 细菌生长

   Chung等建立了抑制分枝杆菌生长化合物的高通量筛选方法。选择了一种腐生性分枝杆菌代替结核分枝杆菌，因其具有生长迅速以及非感染性的特点。通过测定细胞摄入放射性标记的尿嘧啶，考察受试化合物对分枝杆菌活力的作用。用96孔板的形式，1d内可以测试数千个样品。

生物色谱联用技术

      大多数药物发挥疗效的重要条件是与细胞膜上的受体、酶、靶细胞等结合或进入细胞内部，从而使细胞发生凋亡、分裂或细胞周期停滞等反应。用与疾病相关的酶或受体作为诱饵靶标，直接从复杂的中药提取物中快速、灵敏、准确地提取活性小分子，从而使筛选效率成倍提升。

      目前已经发展形成了二维涡流色谱法、超滤质谱联用技术以及细胞膜色谱法等等。虽然该方法得到的活性成分量少，难以进行化学结构鉴定和药理验证，但技术能够高效、快速揭示中药药效物质基础并排除杂质成分干扰，便于药物药效活性验证、追踪，为我国广大从事中药研究的药物研究科学家们提供了一个思路和方向。

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