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forgetbuct木虫 (小有名气)
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[交流]
【求助】荧光分析中的倍频峰
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| 做荧光分析的时候，发现自己的发射波长被倍频峰掩盖，而文献上用相同的激发波长时，而它的发射波长不会被倍频所掩盖，请教是否有手段可以消除倍频峰？仪器用的是F-7000，希望高手指教，谢谢！ |
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zhangwq
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9楼2009-04-04 14:20:19
2楼2009-04-02 10:37:17
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opq691(金币+2,VIP+0):鼓励新虫参加讨论，回复不错，对新虫很有启发，奖励两个，欢迎常来分析版 4-2 11:49
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推荐你看个帖子，http://chem8.org/viewthread-18725.html （化学吧！~）。 中午没事，上了chem. commun. 的网站看看最近有哪些advanced article，结果发现今天有篇“comment”，虽然标题中没有“comment”，但内容的核心就是指出chem. commun. 最近一篇文章的结论是artifact! 因为对荧光比较感兴趣，所以就把这两篇文章仔细看了一遍，下面给大家简介一下： 先讲一下被comment的工作，也就是Naoki Komatsu小组发表于Chem. Commun., 2008, 1196-1198的“Unexpectedly large binding constants of azulenes with fullerenes”（http://www.rsc.org/publishing/jo ... le.asp?doi=b718392e），文中主要的内容是发现azulene和fullerene（包括C60和C70）有比较大的结合常数，在104–105的数量级。作者利用的荧光滴定的方法发现体系的荧光随着fullerene的加入而逐渐降低，然后利用荧光强度的变化算出的结合常数，以及结合比例（1：1）。为了获得二者的具体作用模式，作者还利用理论计算的方法分析了可能的复合物的结构。此外，作者还采用了动态光散射来分析了作用前后的particle size,发现体系的尺寸从1.0nm增至1.3－1.4nm，进一步证明二者存在强的结合。 再说说今天刚出炉的这篇"comment", （见http://www.rsc.org/Publishing/Jo ... le.asp?doi=b808357f）因为是advanced article, 还没有PDF文件。作者在标题中就开门见山－－“A reassessment of the association between azulene and [60]fullerene. Possible pitfalls in the determination of binding constants through fluorescence spectroscopy”。 作者在文中指出，前文的结论是实验中的假象，Komatsu等人在用荧光方法来测定二者的作用时可能存在一些明显的操作或实验设计的错误，从而导致了错误的结论－－surprisingly large association constant 。 首先，作者怀疑前文中的750nm处的荧光峰并非是azulene的荧光峰，而是由于光栅的二级衍射产生，即我们常说的“倍频峰”。由于azulene本身在375nm处有一荧光发射峰，所以若没有采用滤光片时，一般都会在750nm观察到一个倍频峰。为了证实这一怀疑，comment文的作者在仪器上加了一590nm的滤光片，结果发现在650-825内确实无荧光峰（见上图的虚线），表明原文中的750nm处确实为倍频峰，而非azulene的荧光峰。而且另一个位于680nm处的峰实质上也是源于激发光的Rayleigh散射。 另外一个大的问题就是荧光测试中的内滤效应。也就是，测试体系在激发或发射波长出的吸光度值不能太高，不然会影响荧光分子对激发光的吸收程度或是由于体系的吸收而减弱荧光分子发出的荧光，从而会影响到体系的荧光强度。这一点，在荧光实验中应该尤其注意，本人在刚接触荧光时就曾在这上面栽过一次，呵呵。从上图可以看出，原文作者的体系在激发波长出的吸光度值至少大于0.2，且加入的c60在激发波长350nm处有明显的吸收. 因而加入C60后，由于体系在激发波长出的吸光度值也跟着增加，必会降低体系的荧光强度。comment的作者在优化实验条件下测试表明，加入c60后体系的荧光强度的变化几乎都是由于内滤效应所致，所以azulene–C60 之间并无明显的相互作用。 最后，作者还详列了其它荧光实验中可能会出现假象的地方，比如根据Stern-Volmer算出的常数并不能等同于结合常数，荧光分子的光漂白也可能会造成荧光强度减弱等。 [ Last edited by yiyayiyayo on 2009-4-2 at 10:46 ] |
3楼2009-04-02 10:44:47
4楼2009-04-02 10:47:45