[交流] Cacl2制备的大肠杆菌EC1000感受态老是转化不成功，寸草不生！！！ 已有5人参与

购买的大肠杆菌EC1000感受态和PORI280质粒，用Cacl2法制备EC1000感受态，怎么做都转化不出来。急急急！！！ 感受态制备方法如下： 37℃温箱培养12-16 h后，挑取生长良好的单个菌落，接种于5 mL LB液体培养基中，37℃，250-300 r/min振荡培养5-6 h。 2）将适量活化后的菌液无菌转接到装有50 mL LB的盐水瓶中，继续振荡培养约2.5-3 h，至OD600nm值达到0.5-0.6时，在无菌条件下将细菌转移到一个无菌的用冰预冷的50 mL聚丙烯离心管中，冰上放置30 min。 3）4℃ 4000 r/min离心10 min，弃上清，将离心管倒置1 min使残留培养液流尽后，于沉淀中加入10 mL冰预冷的0.1 mol/L CaCl2重悬沉淀，冰浴30 min。 4） 4℃ 4000 r/min离心10 min，弃上清，沉淀中加入用冰预冷的0.1 mol/L CaCl2约2 mL（视细菌量而定），轻轻重悬菌体，即为制备好的感受态细胞，可直接取少量（约100 μL）马上用于转化或放冰浴中置4℃短期存放（一般于3 d内用完）。可加入终浓度15%无菌甘油，分装0.1 mL/管，-70℃冰箱保存备用。 转化方法： 把感受态细胞置于冰中融化。 2. 把100uL的感受态细胞移至灭菌处理的试管内。 3. 加入用于转化的DNA（10 ng以下）。 4. 冰中放置30分钟。 5. 42℃ 放置90秒。 6. 冰中放置5分钟。 7. 加入37℃预温好的SOC培养基，使终体积为1 ml。 8. 37℃振荡培养1小时（160～225 rpm）。 9. 6000rpm 离心，弃上清，保留100uL左右菌液重悬混匀后吸取并涂布琼脂平板培养基。 10. 37℃过夜培养。 CaCl2也重新买了sigma分装的，同时转化PORI280质粒和PUC19质粒，PORI280的涂布的是红霉素抗性SOC平板和LB平板，PUC19涂布的是氨苄抗性的SOC平板和LB平板，PORI280平板没有长菌落，PUC19平板长了菌落，我用PCR检测和小提质粒跑胶检测都未检测到阳性菌落。 怎么破呀！！！！

回复此楼