| 查看: 2234 | 回复: 10 | |||
| 【有奖交流】积极回复本帖子，参与交流，就有机会分得作者 daming_yj 的 5 个金币 | |||
[交流]
qPCR大神看过来！
|
|||
|
最近小白正在学习qPCR，由于之前会做qPCR的师姐们已经毕业了，所以在按照她们毕业论文里面的步骤进行模仿实验。 标准品质粒是找公司合成的，拿回来的序列也已经BLAST过了。质粒浓度200ng/ul，260/280=1.9，目测质粒是OK的。 然后梯度稀释，共8个梯度，每次稀释10倍。稀释过程就是5ul原液加入45ul超纯水中，先吹打40-50次，再涡旋30s，中间伴随着手指弹和离心。 最后就是25ul体系：12.5ul SYBR GREEN MIX；正反引物（0.2mM）各1ul；BSA 0.3ul；超纯水 9.2ul；DNA 1ul。程序也是按照之前师姐论文里面的设置的。 然而qPCR跑出来的结果就是质粒只有前几个浓度还有，后面几个Ct值过高检测不到。 请各位大神帮忙找下问题所在，多谢！  微信图片_20180808104232.jpg  微信图片_20180808104226.jpg  微信图片_20180808104220.jpg |
回复此楼» 猜你喜欢
球磨纳米粒子条件
已经有6人回复
-
球磨分散剂
已经有4人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有67人回复
-
阴阳离子交换剂！！！！
已经有3人回复
-
二苄基磷酰氯，磷酸接酚羟基，
已经有11人回复
-
二苄基磷酰氯，磷酰氯
已经有10人回复
-
酸酐或者羧酸酰氯化
已经有15人回复
-
酚羟基接入磷酸，磷酸酯化
已经有26人回复
2楼2018-08-08 11:19:53
3楼2018-08-08 11:30:34
4楼2018-08-08 11:50:26
用户晓晓
木虫 (正式写手)
- MolEPI: 1
- 应助: 45 (小学生)
- 金币: 1688.7
- 散金: 129
- 红花: 12
- 帖子: 605
- 在线: 104.8小时
- 虫号: 1474220
- 注册: 2011-11-03
- 性别: GG
- 专业: 细胞增殖、生长与分化
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
daming_yj: 金币+5 2018-08-08 14:47:30
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
daming_yj: 金币+5 2018-08-08 14:47:30
|
1，要做标准曲线 首要考虑的是让你的不同浓度梯度的样本的CT值都落在一个合适的范围内（荧光定量的一般合适的CT值大概在15-30之间）。 2，“可是每次稀释两倍的话，如何保证我的样品浓度落在标曲的区域内呢？”这句话你考虑的是让稀释后的浓度落在你的标准曲线的浓度范围内，可是你现在不是在做标准曲线嘛，没有标准曲线之前哪里来的合适的浓度？ 3，现在你做了10倍稀释了，但是没有看到你的CT值的数据。现在你已经可以根据你的CT值的数据大概判断一个CT只合适的浓度范围了（比如说原液 10被稀释样品 100倍稀释样品VT值都在30以下，那么就可以判断为合适的浓度大概在200-2）。下面就是根据这个合适的浓度重新设计浓度梯度，可以5倍稀释，也可以两倍稀释。 做标准曲线目的就是确定一个合适的浓度梯度范围，然后拿到计算公式。 祝试验顺利！ |
5楼2018-08-08 12:54:45
6楼2018-08-08 15:43:09
daming_yj7楼2018-08-08 16:09:28
8楼2018-08-08 16:15:03
9楼2018-08-13 11:42:21
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
|
本帖内容被屏蔽 |
10楼2018-08-22 11:16:47
5