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qRT-PCR表达量计算的问题 求大侠帮助啊！！！！ 已有1人参与
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在做氨氧化菌的功能基因表达，提取了菌株的RNA，用qRT-PCR方法、16SrRNA做内参，检测了不同培养时间的amoA、hao、nirK和norB 四个基因的变化。已经得到了基因的Ct值，可以根据“∆Ct=目标基因-内参基因”计算得到∆Ct，但是由于没有对照组，所以不知道如何计算2-∆∆Ct了。Sample Text 看到有些文献是以拷贝数单位，不知道拷贝数是如何计算的？怎么把Ct值转换为拷贝数。Sample Text |
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2楼2018-08-02 19:14:36
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是的，非常感谢热情指导。如果没有对照组的话，是不是就不能用相对表达量来计算了？我看了许多文献，都是分别用内参和目的基因的质粒10倍梯度稀释，作标准曲线。用其CT值和拷贝数得到线性方程。然后将样品的CT值带入方程中，计算出样品中的拷贝数。但是这里就有个疑问了，在做qPCR时用的模板是细菌的cDNA得到的目的基因的Ct（目的基因碱基数为116），而标准曲线是以cDNA为模板扩增后的目的基因插入到质粒后得到的Ct（这里的碱基数是质粒的+目的基因，如pGEMT质粒碱基数为3003，目的基因碱基数为116）。而拷贝数的计算涉及到碱基数和模板浓度，标准曲线用的模板的碱基数和浓度都是质粒，和qPCR用到cDNA，所以这样得到的两个Ct是一致的吗？ 拷贝数计算公式为(6.02×1023拷贝数/摩尔)×(模板浓度， g/ml)/(基因的平均分子质量=碱基数x660 道尔顿/碱基，MW g/mol)=copies/ml。 |
3楼2018-08-03 11:18:13