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疏水层析上样后结合多长时间？ 已有1人参与
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小弟最近准备做疏水层析，第一次做不知道是否上样后直接洗脱还是需要结合一段时间才能洗脱。谢谢。 20以及如果能够给出用akta纯化的步骤更加感谢。@hc-material |
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2楼2018-07-26 11:41:46
hc-material
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- 管辖: 生物科学
【答案】应助回帖
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问题太笼统，多大柱子，可以直接洗脱。 可参考下面： a.水洗 用5-10CV纯化水以0.5ml/min(HT 1ml)或2.0ml/min(HT 5ml)清洗介质。 备注：此步骤用于去除介质中20%乙醇。 b.平衡 用5-10CV平衡液以0.5ml/min(HT 1ml)或2.0ml/min(HT 5ml)平衡介质，直至基线平稳后调零。 备注：此步骤用于平衡介质，保证介质中的溶液的组分和pH与样本一致。 c.上样 样本经过离心、过滤（0.45um）后以0.5ml/min(HT 1ml)或1.0ml/min(HT 5ml)进行上样，上样完成后用平衡液进清洗直至基线为零。 备注：样本中的离子强度和pH务必和平衡液保持一致。 d.洗脱（根据客户的设备条件选择不同的洗脱方式） 线性梯度洗脱（使用层析系统）：0%-100%洗脱液，20CV，以0.5ml/min(HT 1ml)或2.0ml/min(HT 5ml)流速进行线性梯度洗脱，收集洗脱峰。 阶梯式洗脱（使用蠕动泵）：采用逐渐降低盐浓度的方式以0.5ml/min(HT 1ml)或2.0ml/min(HT 5ml)的流速进行阶梯式洗。 备注：强烈推荐进行线性梯度洗脱；如果采用阶梯式洗脱，需要配制一系列不同盐浓度的洗脱液*。 *：洗脱液Ⅰ-0.05M PB、1.50M (NH4)2SO4，pH 7.0； 洗脱液Ⅱ-0.05M PB、1.25M (NH4)2SO4，pH 7.0； 洗脱液Ⅲ-0.05M PB、1.00M (NH4)2SO4，pH 7.0； 洗脱液Ⅳ-0.05M PB、0.75M (NH4)2SO4，pH 7.0； 洗脱液Ⅴ-0.05M PB、0.50M (NH4)2SO4，pH 7.0； 洗脱液Ⅵ-0.05M PB、0.25M (NH4)2SO4，pH 7.0； 洗脱液Ⅶ-0.05M PB，pH 7.0。 e.水洗 用5-10CV纯化水以0.5ml/min(HT 1ml)或2.0ml/min(HT 5ml)清洗介质。 备注：此步骤用于去除介质中洗脱液。 f.保存 用5-10CV 贮存液以0.5ml/min(HT 1ml)或2.0ml/min(HT 5ml)清洗介质后保存。 备注：贮存液可以防止微生物的生长。 g.溶液配制 平衡液：0.05M PB、1.70M (NH4)2SO4，调节pH 7.0，室温保存。 备注：在高盐浓度下，一些蛋白可能会沉淀，建议检测不同盐浓度下蛋白质的溶解性和稳定性； 当使用(NH4)2SO4时，溶液的pH≤8.0。 洗脱液：0.05M PB4，调节pH 7.0，室温保存。 贮存液：20%乙醇，室温保存。 |
3楼2018-07-31 13:28:38
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