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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 紧急求助 TA克隆
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yuanfeng

金虫 (小有名气)

[交流] 紧急求助 TA克隆

各位高手，小弟这几天做TA克隆总是什么也不长？大家有遇到这种情况吗？指导一下吧  谢谢
我用的是Transgen的平端载体 片段用Pfu P的。片段量大约15ng/ul 、1500bp,载体10ng/ul 、3800bp，我用的是各1ul,25度连接15分钟。可是转化后什么都没有。感受态没问题，已经验证过了。是不是我的片段加的太少了，可是说明书上说总体系不要超过5ul，片段最多加4ul。
大家有没有也遇到过什么都不长的问题，告诉我一下经验吧。万分感谢。
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1楼 2009-03-27 14:04:38
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
国产的东西就是容易不稳定
好用的时候觉得挺便宜，很实在，但是质量的不稳定性就是不敢恭维
还是用promega的T-easy吧
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2楼2009-03-27 14:18:43
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如水之星

银虫 (小有名气)
我都是用四微升啊，长的挺多
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3楼2009-03-27 17:49:53
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yuanfeng

金虫 (小有名气)
哦 那我回来也用一下4ul吧
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4楼2009-03-27 18:13:43
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献
pfu P出来的要加A后才能用于连接哈,你P出来的产物直接连接能连出来么
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The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
5楼2009-03-27 20:53:22
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月月大可

木虫 (著名写手)
pfu出来的不能在3‘段加A，直接TA连接肯定连不上。建议pfu扩增的产物出来后用氯仿异戊醇抽提一下，70%乙醇沉淀，再加水重新溶解，然后配制成Taq反应体系，72度反应30分钟。然后可以回收后进行TA连接。
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6楼2009-03-27 22:06:07
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jqq1985

银虫 (正式写手)
PFU是不是平端酶 啊 ，换下EX-taq，那个PCR完成时会在你片段后面自动加个A，所以这个PCR酶扩增的片段可以直接TA克隆
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7楼2009-03-27 23:31:04
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