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细胞凋亡 ——当前生命科学研究的热点课题
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蒋争几 翟中和 摘要 细胞凋亡是当前生命科学研究中最热门的领域之一，近几年约研全会得了许多重大突破．对凋亡中的热点问题，包括细胞接受胞内外信号的刺激启动凋亡、胞内凋亡特异性蛋白酶阳9a肥的话化、阳9a肥对细胞结构的降解、线粒体及Bcl—2蛋白家族对凋亡的调控等方面的许多令人瞩目的进展做了介绍．此外，还专门介绍了非细胞体系对细跑凋亡研究的重要贡献 细胞调亡(叩optosiB)与细胞编程性死亡(pn3pwImld ceU deatk)本是略有差异的概念，现在已习惯为同义名词．它是一种高度有序的细胞死亡，在这个过程中细胞将自己分割成由膜包被的小体而自杀‘ 细胞凋亡在多细胞动物的发育、形态建成与维持中扮演至关重要的角色，与细胞增殖、分化和衰老起着互补与平衡的作用．几乎所有的哺乳动物细胞都存在凋亡的一整套因子并可被多种胞内外信号所激活．在一般的生物发育中，细胞凋亡的意义不仅在于形态建成，也有利于形成完善的功能，例如免疫系统和中枢神经系统‘因此细胞凋亡的缺陷会导致异常发育‘细胞凋亡在成体中也具有重要作用，如皮肤与消化道中细胞的新陈代谢而消除衰老细胞．一般地说，细胞凋亡与细胞增殖的紧密锅联保证了很多组织能够得到稳定、有控制的新生细胞的供给，而这对成体器官的保持和功能的最好发挥是很重要的．同时，植物细胞与原生生物细胞是否存在凋亡近年已被初步证实，是否与动物细胞凋亡具有相同的调控机理尚待研究．作为细胞的一种基本生命现象，凋亡失控的结果将是可怕的：凋亡不足时，易发生癌变、病毒性疾病和自身免疫疾病，而凋亡过量则可能产生获得性免疫缺陷综合征(W)、重症肝炎与退行性神经疾病，如老年性痴呆症(A协e血“’s d5M)、帕金森氏症(Pa2tiWn’s d比Me)．因此研究细胞凋亡及其机理具有重要的理论和实践意义．细胞凋亡是当前生命科学研究中最热门的领域之一，根据美国15I(MMal50nSclencesh5t5tuIe)对1D7年5CI收录及引用论文关键词检索发现．全球自然科学研究中论文发表最集中的3个领域分别是细胞信号转导、细胞凋亡和基因组研究‘截止到1四8年的5年内发表了2万多篇有关细胞凋亡的文章。L＼．我国在细胞凋亡研究领域虽然起步较晚，但已有多家单位从事这一方面的研究并取得进展， 目前，对细胞凋亡的研究主要集中在如下几个方面，细胞接受胞内外信号的刺激启动凋亡、胞内凋亡特异性蛋白酶cMpge3的活化、cg9a50对细胞结构的降解、线粒体及Bcl—2蛋白家族对凋亡的调控等‘下面将分别叙述． 1细胞凋亡信号的转导与调节 凋亡是通过一系列复杂的信号转导通路来实现的．细胞外部的生存信号与内部感受细胞完整性的感受器监控着细胞凋亡机制．细胞是继续存话还是进入凋亡是细胞必需首先加以决择的事件．细胞依赖于持续的存活信号，即自分泌或旁分泌的生长因子的刺激以维持生存．避免凋亡．如果细胞与周围失去联系或受到无法修复的损伤，细胞就会开始凋亡．细胞同时收到促进或延缓分裂的矛盾信号时也会开始凋亡．一些环境的胁迫(stM)，如热、LV辐射以及高渗，也可引发凋亡．哺乳动物中存在另…种机制可使机体主动引起某个细胞自我毁灭．这种。指令”性凋亡在免疫系统中尤为重要．死亡受体是传导特定死亡配体带来的凋亡信号的细胞表面受体，它在“指令”性凋亡中是很重要的．这些受体可在配体结合后几秒钟内活化cM·四M，使细胞几小时内凋亡[21． 死亡受体居于肿瘤坏死因子基因家族，其共同特征是都有相似的、富含半腆氨酸的细胞外结构域．死亡受体还有一个同源的、称为死亡结构域的胞内序列．死亡结构域一般使死亡受体与胞内凋亡机制相连L3．4—，但它们有时也会介导与调亡无关或抑制凋亡的过程． (i)通过F9的信号转导．FM和FML在3种生理性凋亡中起重要作用：‘—： (1)免疫应答结束后对外周活化的成熟T细胞的去除； (2)通过细胞毒性T细胞和自然杀伤细胞杀伤靶体如病毒感染细胞或癌细胞； (3)在免疫特免位置如眼睛处对炎症细胞的杀伤． 与其他INF家族成员一样，FML也是一个同源三聚体分子，每个FML三聚体与3个FM分子结合．因为死亡结构域有彼此结合的趋势，Fs的靠近会使受体的死亡结构域聚集；一种叫做P入DD(胁g9c比eddeath do晌n)的接头蛋白质[5j，通过自身死亡结构域与聚集的受体死亡结构域结合．FADD还含有一个死亡效应结构域(DED)可与酶原形式的‘Dpe—8中类似的回文重复的D四结构域结合“n．。哪e—8的寡聚化导致其通过自身切割使酶活化．最近的研究表明，细胞内可能存在两条Fa5信号转导通路活化casP5M[8I．在FM I型细胞中，有相当数量的。哪e—8被活化，活化的cM9aM·8通过切割。即Me·3，M‘9as*6和cMpMe—7直接激活这些下游的。Mpes〔，，，DJ并引发线粒体的损伤．在FM n型细胞中，只有少量的Mpx—8活化．”5P5e·8主要通过诱导细胞色素c从线粒体释放活化tpd—1，再使c“阴6—9活化·，，，，2Z． (H)通过1N四1的信号传导．1N厂主要是由因感染而活化的巨噬细胞和T细胞产生的．通过INFRl，1NF激活转录因子NF《B和JyK／—v—1诱导与炎症反应和免疫调控相关的基因的表达．在一些类型的细胞中，W也可通过1w四1诱导凋亡．与FM不同的是，W诱导的凋亡必须有蛋白合成的抑制，表明细胞内存在一些可抑制W诱导凋亡的因子．而这些抑制性蛋白的表达可能是通过yF—MB和JNK／AP—1控制的，因为这两条途径中任何一条被抑制都会使细胞对W引发的调亡变得敏感，31．因此，IN四—1活化的结果可能导致凋亡途径的激活、JNK活化以及NF—KB的活化[14．而1N取信号传导的结果取决于细胞对所有信号传导的整合． FADD将。Mpe—8与1NFRl—冗L4DD复合体锅联并将其活化，从而引发凋亡．剔除P—OD基因的细胞无法发生1NF诱导的凋亡，表明P—OD在此反应中是必需的．除F—4DD外．川四1还pJ与一个称作KAmD或cRADD的接头分子结合：，5I．K41DD通过死亡结构域与NP的死亡结构域结合，通过一个CAI①(C哪tecMi咖foMin)序列与死亡效应分子Mpb2结合。从而诱导凋亡． 此外，细胞还通过DB3，DR4和DR5的信号转导对细胞的凋亡进行调控复杂在此不再细述．2则pa肥蛋白酶的活化及其在凋亡通路中的主导作用由于其机理较为 L，J‘明mM则5erV勺待oL．”5P5es足一突半恍氨酸(Cys)蛋白酶，根据同源性高低将其分为3类(类ICK、类CP四2、类bhl)，它们无论在氨基酸序列、结构与底物特异性方面都有相似性L16J． 目前已发现13种。哪es，它们在凋亡与炎症反应中发挥截然不同的作用．在凋亡过程中，c“pMes不仅是细胞解体的效应器，而且在接受信号后启动凋亡中发挥重要的启动子作用． 。MpMes均以酶原的形式存在，含有3个结构域，一个y隘—端结构域，一个大的亚单位(*20ku)和一个小的亚单位(＝10ku)，其活化过程包括结构域间的解离及2个亚单位形成一个异源二聚体．2个异源二聚体相连形成四聚体及2个催化垃点，它们独立行使功能：，7I．酶对底物有特异性，佃9a汾1(ICE)的底物残基识别序列为Y1f—4刀，船5P朋—3为DEVD，哪侧—6为VEID．不同州es底物特异性序列的差别导致了其广泛的生物学功能—，81．不仅如此，并非所有含有其特异性序列的蛋白质会被对应的。哪降解，表明在底物识别过程中三级结构具有重要作用． (II)“9aM的话化．最近的研究“，’金明。叫mM的话化主要通过两种不同的机制进行—其中一种是利用在凋亡过程中起伴侣作用的蛋白分子来使无活性的酶原聚集在一起，以提高其局部浓度，有利于无活性的前体形成活性构象．另一方面，由于所有c“Pges的降解有相似的专一性，因而活化。哪es前体(Ro)最简单的方式是将其直接传递给已经活化的Q6px分子、在细胞内作为下游效应物的c叼M5M(加：cMpM，3，“9a》6及c“PMe—7)的活化广泛采用这种c“pMes级联反应机制．此外，c6Pg也可通过被其他种类蛋白酶的水解而激活，如M·pB，3、可被Ck细胞杀伤作用的重要因子se6ne类蛋白酶GrMzPne B直接水解激活“”． “诱导靠近％的方式．这种机制首先在cM帅8的话化过程中发现．FM受体分子在配体结合后聚集成复合体．这种信号复合体通过NDD招算数个ca5pMe·8前体，从而使”sP5e·8前体的局部浓度升高．在这种情况下，cgpMs前体固有的很低的蛋白酶活性足以驱动与受体相联系的cMpMe·8前体相互水解而活化”i． (m)cg9aA9对细胞结构的降解．c”阴的一个功能是使抑制凋亡的蛋白失活，如使产‘。失活从而消除其对CAD(哪px·act51ateddMK6Lonucle踢e)的抑制作用，CAD恢复其核酸酶的活性，特异性降解DK—4〔2J．此外，Bbt—2也在凋亡活化过程中被c“P3es降解，而且降解后形成的片段还可促进凋亡LDi． cgpxs可直接作用于细胞结构并使之解离．如对核纤层蛋白(比n1M)的降解Lx—．同时，cM哪通过降解一些与细胞骨架调控相关的蛋白质来重组细胞结构．如对ge切比·xJ，F4K(fMaldhesion kiHa5e)〔xJ及P—4搬(p2l·印nlra创kln踢e 2)的降解L27J． 另外，cMpMes一个重要功能是使蛋白的调控区与功能区相互解离．通过这种方式进行负调控主要参与洲A修复(如DNA—PItcs)、船tNA剪接(如Ul—70K)及DNA复制的灭话Lm79j， 目前已发现的c踢pMo的底物还包括SBEBP2·川i，比16n A，Lanln C，yuMA，DNA Ioplso·merMI，蛋白激酶C玲311，MDM2。?21及BL蛋6L”等． 总之，c“pg在凋亡的执行过程中以一种很有程序的方式对细胞进行解体．它们切断调亡细胞与周围细胞之间的联系、关闭DNA的复制与修复、阻断洲A的剪接、降解DNA、破坏核的结构、诱导细胞向外发出信号以便被周围的细胞吞噬、最后将细胞解体并包裹形成凋亡小体．随着c“pg新底物的不断发现，人们对调亡降解细胞的认识也不断深入12LJ．3 线粒体在凋亡调控中的作用 在脊椎动物细胞的凋亡过程中，线粒体被认为是处于凋亡调控的中心位置．细胞色素c从线粒体释放与胞浆中4pafl(线虫CED—4的同源物)结合活化cMpa5e 9，进而激活c“pMe 3LH，35J，导致细胞凋亡．BcL2通过阻止细胞色素c从线粒体的释放来抑制凋亡〔36，yJ；而Bax通过与线粒体上的膜通道结合促使细胞色素c的释放而促进凋亡“i．最近的研究表明，FD途径中c“P5e‘8活化后切割脑浆内的Bjd(BcL2家族成员)，使之进入线粒体，引发细胞色素c高效释放．Bid诱导细胞色素c释放的效率远高于此1201di‘ 线粒体释放的另一凋亡诱导因子是A赃，其分子量为57ku，是一种黄素蛋白．正常生理状态下，A赃被封闭于线粒体中，在细胞发生凋亡时被转运人细胞核．重组的AIF能诱导细胞核中染色质凝集和DY—4大规模降解． A赃还能诱导纯化的线粒体释放细胞色素c和c踢P踢e·9[41，42]．4Bd．2家族蛋白与凋亡调控 BcL2是一个大的蛋白家族，许多(但非全部)Bcl—2家族蛋白定位于线粒体外膜．由其C端疏水区域锚定在膜上，蛋白朝向胞质6i． 目前已知的Bcl—2基因有十余种，分为两大类，分别抑制凋亡或促进凋亡．其中BcL2，加和Bid的功能在前面已作了介绍．不同类的BcL2蛋白分别具有不同的BH(M—2hoM)10趴)结构域．包括朋1，B股，BH3和BN，在抑制凋亡的BcL2 类蛋白中，这些结构域都起重要作用％16·；而在促进凋亡的BcL2类蛋白中，肋结构域是必需的．在爪瞻卵非细胞体系中，甚至单独的闭记结构域即可引发细胞色素c的释放及cMpM的话化r6j．Bcl4通过BH结构域形成二聚体或与其他凋亡促进蛋白结合，发挥抑制细胞凋亡的功能．细胞内两类蛋白的含量和功能状态之间的平衡是细胞调控凋亡的重要机制．如细胞DNA损伤后，p53诱导BM转录，而使细胞走向凋亡L4r．5利用非细胞体系研究细胞凋亡 在体内或细胞水平研究凋亡的生化机制非常困难．这不仅表现为凋亡细胞的同步性很低，凋亡时间很短，而且由于细胞内各种因子相互作用，调控机制极其复杂，使分子生物学技术应用于细胞水平的研究存在很大的困难． 应用非细胞体系来研究凋亡可弥补上述不足．以往的研究表明，利用非细胞体系研究胞内复杂的生化活动具有独特的优越性，在细胞周期调控、DNA复制、核小体与染色质构建等的研究中发挥了重要作用．非细胞凋亡体系使人们的研究与分子生物学技术容易结合起来，便于在亚细胞及分子水平对细胞凋亡的各种调控因子进行研究．为细胞凋亡的研究起到很大的促进作用． 1993年．Idze比iL等人Lo最早创建了利用非细胞体系来研究细胞凋亡的模式．他们用两次同步化的鸡肝癌细胞DL，249制备提取物，加入外源纯化的细胞核，观察到典型的凋亡现象．这对人们后来建立多种非细胞凋亡体系具有开创性的意义． NMeYer等人EdI利用非洲爪婚卵提取物建立了一种非细胞凋亡体系，并发现线粒体组分中的因子对于诱导非细胞体系的凋亡是必需的．这种凋亡体系还存在处，如制备周期长、制备物本身就是凋亡体系，不能用于研究启动凋亡的因子． 19N年，Lu等人Ld‘建立了一种新的非细胞凋亡体系制备方法，使凋亡在非细胞体系的研究迈进了一大步．他们用帅诱导Heb细胞提取物发生凋亡，证明细胞色素c是凋亡诱导过程的必需因子．他们对细胞提取物的大规模制备和分析，使人们分离鉴定哺乳动物细胞内凋亡关健因子的梦想变为可能． 1卿年，Ym9等人〔川和K1nck等人[n1同时证明Bcl—2通过阻止细胞色素c从线粒体膜上释放发挥其抑制凋亡的作用．加等人：yrDJ在此基础上，分离纯化得到tP办1，并发现是Ced—4的同源物，细胞色素c与脑浆中tpd—l结合并活化cgpue—9，进而激活cMpue 3，导致细胞凋亡的施，另一方面，SMsiM等人“‘利用非细胞体系证实了线粒体释放的另一种调亡诱导因子AIF及其作用机理，对人们了解线粒体在凋亡调控网络中的重要作用提供了新的证据． 我们实验室从上述的工作得到启发，并结合以往非细胞体系核重建的经验，不失时机地建立了非细胞凋亡体系．我们首先按照核重建的方法制备得到了爪脂卵提取物，通过加入L4呼和细胞色素c，得到了能有效诱导凋亡的非细胞体系．被诱导凋亡的小鼠肝细胞核在形态上表现出明显的阅亡特征。N1．这种非细胞凋亡体系来源于正常而非已诱导凋亡的卵细胞，可用于研究凋亡启动的关健因子；在爪聘卵中储备有大量的物质，对凋亡过程中多种因子的研究极为便利，如揭示凋亡特异的核酸内切酶．我们的研究发现，细胞色素c可以直接激活卯提取物中的凋亡特异核酸酶．菌分子量约为27LuLslI‘2J．这些结果表明，细胞色素c激活cglN》3的调亡途径同样存在于爪婚卵细胞中．最近，我们与清华大学细胞生物室应用植物细胞脑浆提取物建立了非细胞凋亡诱导体系，为研究植物细胞凋亡机理提供了方便的实验模式(见下节)．6植物细胞凋亡 植物细胞中发生的处于特定部位的具有显著生物学意义的细胞死亡，包括坏死、超敏反应、繁殖、组织分化及自然衰老，它们的遗传学基础及代谢过程都不清楚。5；“j．研究植物细胞应答于外界环境的压力而发生死亡的分子生物学基础，探索与植物抗性基因工程有关的基因及基因产物进而通过改变植物体相关基因的表达来增强植物的抗性，对于人类的生存是很有意义的． 植物体内处于一定发育阶段的细胞Lg·或受到病原体作用的细胞[XI为保持自身的体内平衡可发生死亡．现在，越来越多的工作认为在植物—微生物不相容共生体中存在与超敏感有关的细胞死亡·刘，其特点与动物细胞的凋亡相类似．MiN“等人通过原位检测DY—A断裂的方法发现在植物木质部分化及抗病基因的表达过程中出现特异性核酸酶对DK—A在核小体间的切害g[57]， wang等人利用一种与鞘氨醇(9Ph”卿m6)相关的真菌毒京矾诱导番茄原生质体及小叶片发生凋亡，发现了典型的凋亡小体与DNA kdder，最近我们实验室与清华大学合作的研究表明，VK3处理的烟草细胞原生质体表现出类似凋亡的变化，不仅有凋亡小体类似结构与DY—A1办der的出现，还观察到1a加M的降解Lg·．此外，还证明细胞色素c能诱导植物细胞原生质体的凋亡E9：． 虽然植物中发现的类似凋亡的现象在不断增加，但在分子水平的证据却很有限，这是因为在植物中寻找类似的表达产物非常困难Lo：．对于被诱导的基因，在某一特定组织中发生凋亡的细胞常常只占所有细胞的很小一部分．为了深入研究植物细胞凋亡的作用机理，建立一个稳定而高效的凋亡诱导体系是非常重要的． 我们在以胡萝r悬浮细胞为材料制备的胡萝r细胞脑浆提取物中，利用细胞色素c诱导了小鼠肝细胞核发生明显的凋亡变化[61．随后的研究表明，纯化的胡萝r细胞核也能在此体系中诱导发生类似的凋亡变化’．上述结果说明，植物细胞中可能存在与动物细胞相似的一整套凋亡机器，而植物非细胞体系诱导凋亡这一实验模式的出现，可为研究调亡在植物细胞内实施的分子机制提供一个良好的体系． 事实上，植物和动物体现了相同的细胞死亡主题，可在特定的限制条件下很不同的表达．例如死亡植物细胞的部分清除是通过液泡的自吞噬而不是异噬，另外植物细胞死亡后经常会成为很重要的结构，很多控制局部细胞死亡进而限制病原体的扩散的植物抗性基因与控制动物细胞死亡的基因有一些相同之处：u． 总之，细胞凋亡的研究方兴未艾，新发现、新结果层出不穷，而非细胞凋亡体系的建立与利用，在很大程度上促进了人们对凋亡机制的研究．对细胞凋亡机理的深入了解将有可能得到有关细胞起源、进化以及发育生物学的新的认识．并可对一些疾病包括癌症提供新的治疗方法和途径，如ca5PMe活化抑制剂已经表明可在几个病理条件下抑制非正常细胞凋亡，为可行的治疗方法带来了乐观的前景．1)赵允，孙英丽，蒋争凡、等．利用植物细胞提取物的非细胞体系诱导胡萝L细胞核凋亡． |
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