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zhaomsy

新虫 (初入文坛)

[求助] 加his标签的蛋白过镍柱后没有挂上的原因??怎么改进 已有1人参与

加his标签的蛋白过镍柱后没有挂上的原因,上样蛋白溶于水中,以水溶液的方式过的柱子。200mM洗脱收集,未检测到蛋白,怀疑未挂上柱,怎么改进
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hc-material

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

没挂柱有几种可能:
1.蛋白表达过程中his被包裹在结构内部,此时就需要加尿素在变性条件下让其暴露出来。
2.His表达的过程中丢失。
3.层析系体不合适,ph太低,或者咪唑浓度高,都会导致不挂柱。
问题描述详细点,然后才能系统分析。祝顺利。
5楼2018-05-29 16:34:36
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普通回帖

Mr.四娃

金虫 (小有名气)

请确认蛋白表达了吗,用brondford检测下看看是不是形成了包涵体

发自小木虫Android客户端
2楼2018-05-26 16:18:52
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yubeihong

铁杆木虫 (职业作家)


3楼2018-05-26 16:33:45
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hc-material

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

1.首先确定是否表达。可以WB
2.确定到底是没挂柱,还是没洗脱下来。流穿峰跑电泳看看。先找确定具体是什么问题,在分析解决,
4楼2018-05-29 16:28:06
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zhaomsy

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
5楼: Originally posted by hc-material at 2018-05-29 16:34:36
没挂柱有几种可能:
1.蛋白表达过程中his被包裹在结构内部,此时就需要加尿素在变性条件下让其暴露出来。
2.His表达的过程中丢失。
3.层析系体不合适,ph太低,或者咪唑浓度高,都会导致不挂柱。
问题描述详细点 ...

跑胶证明his表达了,但是只能挂柱,尝试用20mM咪唑或磷酸除杂,目的蛋白即会被冲洗下来,与镍柱结合力极弱,请问这种情况如何进行改进?谢谢
6楼2018-06-27 14:59:08
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w.hallo

铜虫 (小有名气)

7楼2018-07-07 16:01:12
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