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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 层析/纯化 » 加his标签的蛋白过镍柱后没有挂上的原因？？怎么改进
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zhaomsy

新虫 (初入文坛)

[求助] 加his标签的蛋白过镍柱后没有挂上的原因？？怎么改进 已有1人参与

加his标签的蛋白过镍柱后没有挂上的原因，上样蛋白溶于水中，以水溶液的方式过的柱子。200mM洗脱收集，未检测到蛋白，怀疑未挂上柱，怎么改进
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1楼 2018-05-26 12:21:52
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回帖置顶 ( 共有1个 )

hc-material

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

没挂柱有几种可能：
1.蛋白表达过程中his被包裹在结构内部，此时就需要加尿素在变性条件下让其暴露出来。
2.His表达的过程中丢失。
3.层析系体不合适，ph太低，或者咪唑浓度高，都会导致不挂柱。
问题描述详细点，然后才能系统分析。祝顺利。
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5楼2018-05-29 16:34:36
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Mr.四娃

金虫 (小有名气)
请确认蛋白表达了吗，用brondford检测下看看是不是形成了包涵体

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2楼2018-05-26 16:18:52
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yubeihong

铁杆木虫 (职业作家)
试试Ni磁珠

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3楼2018-05-26 16:33:45
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hc-material

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

1.首先确定是否表达。可以WB
2.确定到底是没挂柱，还是没洗脱下来。流穿峰跑电泳看看。先找确定具体是什么问题，在分析解决，
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4楼2018-05-29 16:28:06
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zhaomsy

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by hc-material at 2018-05-29 16:34:36
没挂柱有几种可能：
1.蛋白表达过程中his被包裹在结构内部，此时就需要加尿素在变性条件下让其暴露出来。
2.His表达的过程中丢失。
3.层析系体不合适，ph太低，或者咪唑浓度高，都会导致不挂柱。
问题描述详细点 ...

跑胶证明his表达了，但是只能挂柱，尝试用20mM咪唑或磷酸除杂，目的蛋白即会被冲洗下来，与镍柱结合力极弱，请问这种情况如何进行改进？谢谢
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6楼2018-06-27 14:59:08
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w.hallo

铜虫 (小有名气)
遇到了同样的问题

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7楼2018-07-07 16:01:12
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