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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 做蛋白互作的时候，需要去掉基因的信号肽吗？
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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匿名

实习版主

优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！
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1楼 2018-05-12 14:47:30
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在水壹方

管理员

优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！
酵母我们可以做

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2楼2018-05-13 15:44:06
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匿名

主管区长

优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！
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3楼2018-05-13 16:41:24
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用户晓晓

版主

优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2018-05-17 07:51:49
信号肽主要是引导蛋白质跨越细胞膜的一段疏水性肽段，是否需要切除需要考虑两方面的事情：

1，如果该肽段位于N端起始，那么这个信号肽序列一般不参与蛋白三级结构的折叠，且在完成跨膜作用之后一般会被酶水解，也就是最终成熟的蛋白质是不含有该序列的，所以你可以将这段序列去除。
2，有的信号肽是位于蛋白质中间位置的，这样的信号肽很有可能会参与蛋白质的三级结构，人为的破坏蛋白的三级结构再进行蛋白互作 极有可能影响最终的影响！

个人理解，可以探讨！

祝试验顺利！
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4楼2018-05-13 20:22:05
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maoniuniu

专家顾问

优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by 用户晓晓 at 2018-05-13 20:22:05
信号肽主要是引导蛋白质跨越细胞膜的一段疏水性肽段，是否需要切除需要考虑两方面的事情：

1，如果该肽段位于N端起始，那么这个信号肽序列一般不参与蛋白三级结构的折叠，且在完成跨膜作用之后一般会被酶水解，也 ...

这几个因素确实可以考虑，但楼主提到是在蛋白互作实验中是否要去除，这样出发的角度可能不同

对于蛋白互作，如果是in vivo的实验，比如楼主提到的BiFc，又或者是常做的Co-IP等等，这类实验目的是要验证在体内天然状态下，包括蛋白的构象、折叠、定位都要保持天然的状态，然后验证两者间是否互作，一般来说这时候尽量是选用全长，并按需要带有相应的tag
如果是in vitro实验，比如pulldown、SPR等，或者是酵母双杂这种异源实验，一般去除，因为信号肽在这类体系中不需要它行使定位的功能，你可能只需要编码区表达蛋白，或者是在异源系统中进行in vivo的表达即可

虫友所讲的这几种情况，并不适用于蛋白体内互作检测的实验设计

但确实如虫友所讲，要注意你信号肽的位置问题，tag的加入不能与信号肽产生冲突，比如加在N端的tag不能位于信号肽之前，这样会被切掉，或者干扰信号肽的功能，而对于一些比如GPI锚定蛋白，有些信号肽位于中部，在折叠定位于膜上的过程中蛋白的部分区域会被切掉，因此也要注意tag的加入位置，遇到这些情况可能需要将tag加在信号肽附近，保证在后续蛋白加工过程中不被切除
具体问题具体分析
祝好！
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5楼2018-05-16 19:07:04
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用户晓晓

主管区长

优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！
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5楼: Originally posted by maoniuniu at 2018-05-16 23:07:04
这几个因素确实可以考虑，但楼主提到是在蛋白互作实验中是否要去除，这样出发的角度可能不同

对于蛋白互作，如果是in vivo的实验，比如楼主提到的BiFc，又或者是常做的Co-IP等等，这类实验目的是要验证在体内天 ...

不不，既然要体外表达，就只是模拟自然状态，我回答的还是可以考虑。除非是做自然状态下的pull down ，依靠抗体来捕捉天然蛋白，那就没有必要询问这个问题。既然问了是否要改造，就说明楼主要体外表达这个蛋白，可以加标签可以加去信号肽，那就不能算是体内试验了。而且互作最大的影响就是蛋白的三级结构，跟定位没有关系。
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6楼2018-05-16 22:55:51
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MAS_rice

管理员

优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！
酵母好像要分系统，如果是核蛋白可以用takara的Y2H Gold，如果是膜蛋白或者跨膜蛋白就要用分裂泛素化系统，或者Dual hunter系统

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竹杖芒鞋轻胜马，谁怕，一蓑烟雨任平生；回首向来萧瑟处，归去，也无风雨也无晴
7楼2018-05-17 03:19:50
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maoniuniu

专家顾问

优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by 用户晓晓 at 2018-05-16 22:55:51
不不，既然要体外表达，就只是模拟自然状态，我回答的还是可以考虑。除非是做自然状态下的pull down ，依靠抗体来捕捉天然蛋白，那就没有必要询问这个问题。既然问了是否要改造，就说明楼主要体外表达这个蛋白，可 ...


我们的分歧可能还是楼主给的信息太少，假如给个具体的例子我们来分析，可能我们就没有分歧了

但in vivo的情况，我指的是说比如你要在arabidopsis的体系（原生质体或者转基因苗）中分析arabidopsis的基因，又或者在293中做信号通路，一般蛋白互作都是选全长（当然启动子你可以按表达水平的需求来更换，tag位置要按照前面所讲

BiFc一般都是做in vivo的，酵母双杂建议看懂原理，应该就能明白

然后就是亚细胞定位是否要考虑，in vivo的情况下，两个蛋白必须要考虑亚细胞定位，假如两个蛋白定位上天南地北，没有任何关系，即使做出互作结果也是没有意义的，毕竟介导互作的domain太多了，可能随便两个都能，这也是为什么即使你in vitro的互作再强，一般也一定要进行in vivo验证的一个原因

最后，建议楼主自己多看文献多思考，要自己多想想自己的目的、需求是什么，再相应的选择体系，结合体系的特点和原理来设计构建方法

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8楼2018-05-17 08:47:23
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用户晓晓

主管区长

优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！
引用回帖:
8楼: Originally posted by maoniuniu at 2018-05-17 12:47:23

我们的分歧可能还是楼主给的信息太少，假如给个具体的例子我们来分析，可能我们就没有分歧了
但in vivo的情况，我指的是说比如你要在arabidopsis的体系（原生质体或者转基因苗）中分析arabidopsis的基因，又 ...

对滴，说的很有道理！做定位的话最好就能找到特异性的抗体，直接做原位表达。不过这个蛋白既然有信号肽，目测是个分泌型蛋白，定位有难度。。。

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9楼2018-05-17 09:08:15
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maoniuniu

专家顾问

优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！
引用回帖:
9楼: Originally posted by 用户晓晓 at 2018-05-17 09:08:15
对滴，说的很有道理！做定位的话最好就能找到特异性的抗体，直接做原位表达。不过这个蛋白既然有信号肽，目测是个分泌型蛋白，定位有难度。。。
...

所以说楼主给的信息还是太少，不过楼主尽量自己多分析，分析得到方案后如果拿不定主意可以发上来大家讨论

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10楼2018-05-17 09:14:22
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