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饿的神啊新虫 (著名写手)
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qRT-PCR数据处理的疑问（2^-ddCt法） 已有1人参与
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为测定细菌诱导寄主叶片的基因表达，需要对叶片进行接种。为了减小叶片间差异，在同一片上，叶脉左侧清水mock接种，叶脉右侧接种细菌，设置一系列时间点，比如0min，15min，30min，45min，60min，按时取样。目标基因为target，内参基因为actin，这样会得到一系列Ct值，以2^-ddCt法计算相对表达量。 mock treatment Target Ct 0 15 30 45 60 0 15 30 45 60 actin Ct 0 15 30 45 60 0 15 30 45 60 mock dCt0=Target Ct0 -actin Ct0 treatment dCt0=Target Ct0 -actin Ct0 mock dCt15=Target Ct15 -actin Ct15 treatment dCt15=Target Ct15 -actin Ct15 以上应该是没有问题的吧？我的疑问在于，计算ddCt时，是应该用同一时间段的处理组的dCt-对照组的dCt ddCt0=treatment dCt0-mock dCt0 ddCt15=treatment dCt15-mock dCt15 还是将对照组和处理组分组进行计算，各自设置0min时表达量为1 mock ddCt15=mock dCt15-mock dCt0 treatment ddCt15=treatment dCt15-treatment dCt0 困惑已久，查阅很多文献，在这一块都讲的很模糊，只说明用什么内参，用了2^-ddCt还是2^-dCt法，望解惑@starseacow |
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2楼2018-05-12 13:09:17
饿的神啊
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3楼2018-05-12 23:54:36
用户晓晓
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【答案】应助回帖
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楼主这个问题既负责也很简单：首先要确定你的研究的目的是什么，再来确定你的计算方法。 1，试验目的主要在于看处理是否引起该基因表达的变化：那么很简单就是采用处理组减去对照组分别计算，最终得到5个结果（或者5个图），结果能明显看到在哪些时间点的处理引起了目的基因的变化。 2，如果关注的主要问题在于不同时间处理对该基因表达的变化，那么久需要将不同时间点的数据进行比较，势必需要将不同时间点的数据放在一块进行计算。这个首先要考虑下你设置的对照组，设置了5个对照组，在计算时明显是不合适的。所以首先要确定5个对照组是否有实际意义：即将5各对照组进行一次计算，用目的减内参，然后减去5个dCT的平均值。最终计算结果不出意外5个组没有显著差异，结果说明用溶剂（即清水）在任意时间点均不会引起目的基因变化。 在这个前提下，可以顺理成章的进行处理组的计算了：0时间点为对照，不再使用mock组的数据，得出结论可以说明mock多长时间开始能引起该基因的表达变化。 -ddCT的问题：可以减去对照组的平均值，即设置对照组为1，也可以减去所有组的平均值。自己选择。 -ddCT 还是-dCT的问题：在使用同一试验材料（相同的组织，不同的处理）是通常使用-ddCT，使用不同的材料时（计算某基因在不同组织中的表达量）因为组织的额不同，应该采用-dC。 有疑问联系我， 祝试验顺利！！！ |
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4楼2018-05-14 15:08:19
饿的神啊
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送红花一朵 |
非常感谢您的回复，有一下几个疑问向您请教，1.我发现我是同一基因5个水对照之间dCt差异也比较大，比如有一组是-4.55,-5.1,-2.85,-2.1,-4.35，这种情况也是扣除平均值，看有无显著性差异吗？像我这组数据，平均值为-3.79,扣除平均值后分别为-0.76,-1.31,0.94,1.69和-0.56，这样要如何比较有无显著差异啊？T检验是两两比较，单因素方差分析也需要至少两个组啊？ 2.假如这5个数据之间有显著性差异，表明清水处理不同时间后也会引起目的基因的变化，这样的话是不是只能用处理组分别减去各自的对照组来计算啊？ 发自小木虫IOS客户端 |
5楼2018-05-14 21:57:14
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