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Merlintan铁虫 (初入文坛)
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酵母单杂实验问题咨询已有1人参与
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大家好。最近，我做了Y1H实验（我第一次做），有一些问题不是很清楚，如果你有任何经验，希望你能给我一些建议。首先十分感谢。 我使用了的是Clontech的Matchmaker Gold酵母单杂交系统。 以下是我的问题和担忧： 1. 我的基因A预测是转录因子B的靶基因（但可能性比较低，是在Athamap上预测的，但A和B是同一批遗传筛选出来的，导师认为如果能联系在一起就很好了）。然而，Athamap上提供了B的可能的结合位点（不同数据库有差异), 基因A也没有这个元件。所以我将基因A的整个启动子克隆到载体pAbAi中。不知道是否可行？ 2. 我做了pGADT7-B载体，转化含有A启动子的酵母。但转化后酵母生长缓慢，克隆数量也很少，可能4-5天之后，才能看到一些小克隆。但我不认为这是转化和转化效率的问题，因为pGADT7的的空载转化到酵母中，它们生长正常且菌落数量相当好。 A的全长在酵母中有毒性或是什么原因？ 3. 阳性对照pGADT7-p53转化的，也是生长缓慢并且克隆数也少。我们没有kit里的阳性对照，我自己克隆的pGADT7-p53， p53片段来自用于Y2H的pGBKT7-p53。我不知道这个片段是否适合Y1H。在Y1Hprotocol中没有关于p53的信息。 4。如果你从事拟南芥研究，你能推荐Y1H用于阿拉伯糖调控研究的阳性对照吗？ 非常抱歉这是一个很长的问题。但我真的需要你的帮助。期待大家回复。谢谢。  |
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