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生物小虫007

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[交流] 想要探索海洋微生物，问问大牛们选择了哪种测序方案？

微生物的种类浩若繁星，单纯统计细菌，仅1g土壤里就含300万个。毫不夸张地说微生物主宰地球。
与陆地一样，海洋微生物资源极为丰富，并且发现了许多细菌、真菌和微藻可以产生许多生物活性物质。海洋微生物资源、海洋微生物多样性、海洋微生物基因资源和海洋微生物发酵产物和应用是未来的可持续开发利用的深海基因资源，是中国海洋经济发展所依赖的重要战略资源，也是深海生命科学研究的重要材料。
1996年Bult等完成了第一株海洋微生物（从深海热泉口分离到的一株海洋古菌）的测序工作，从而揭开了海洋微生物基因组学研究的序幕。随着测序技术的迅速发展，基因组学已成为研究微生物的重要方法。全基因组可帮助我们认识微生物基因组的结构，功能和进化，阐明整个基因组包含的生理、生态、遗传和进化信息，而宏基因组学的研究方法直接从环境样品中获得基因组DNA并进行分析，可以使我们对海洋微生物有更全面的认识。

研究聚焦一：Pacbio测序探索极端微生物基因组

测序策略：PacBio RS II +Sanger测序
组装结果：基因组大小为61.1 Mb，Contig N50：78.2Kb；Scaffold N50：1.3 Mb，GC含量为38.5%，Scaffold水平。
组学策略：F. cylindrus 在不同环境相关的生长条件进行培育（连续光照、黑暗、低铁、冰冻、升温和CO2），进行RNA-Seq测序。
圆柱拟脆杆藻（F. cylindrus）隶属于羽纹纲、等片藻目、等片藻科、脆杆藻属，已成功在极端环境的南冰洋繁殖生长，并成为极地水域的指示种，可在海冰区域形成大型种群。南冰洋海冰特征明显：水温低于0℃，高盐度，海冰半封闭的孔隙系统导致的溶解气体和无机营养交换的低扩散率。F. cylindrus 应该已经对这种剧烈的环境变化形成了适应性。获得在南冰洋生活的耐冷硅藻——圆柱拟脆杆藻（F. cylindrus）的高质量基因组序列，并与温带海洋中的硅藻进行比较基因组学分析，发现了高度分化的等位基因，在不同环境条件下会有不同的表达，其差异化表达可能与这种硅藻在南冰洋的环境适应性相关。

研究聚焦二：Pacbio测序助力海洋微生物组的物种级解析
测序策略：PacBio RS II测序
全长16S rRNA扩增子测序：
（1）采用的是两步法进行全长16S rRNA扩增：第一步用16S rRNA通用引物扩增，第二步加barcode序列（Figure 2）;
（2）构建两个文库，每个文库包含9个样本，分别测12个Cells，共24个Cells，上机PacBio RS II，P6C4。
组装结果：1.24个Cells共产出28.15Gb，polymerase read的平均读长为25.4Kb，CCS序列平均覆盖圈数为21.2，数据质控后共生成571,710条CCS，平均每个样本约31,761条，质量值在99%以上。

科学家探索了印度洋-太平洋海域中珊瑚相关细菌群落的复杂生态系统，以了解它们的多样性和结构。PacBio全长16S rRNA序列揭示了不同栖息地内细菌的保守特征。
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1楼 2018-04-17 16:10:25

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xp198766

铁杆木虫 (著名写手)

小木虫职业打酱油滴~~！

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★
生物小虫007(金币+1): 谢谢参与

看你的要求了，如果是想相对精确地知道里面有什么东西，做定性，可以使用你说的这种三代测序，特点是读长长，序列相对较少，贵；
如果想知道多样性，群落组成与变化，可以做16S/18S扩增子测序，PE250的hiseq或Miseq PE300都可以；
如果想知道功能组成与变化，可以考虑宏基因组，分析相对复杂。

扩增子测序价格<宏基因组<三代测序，看你的目的的经费支持了

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4楼2018-04-17 17:14:22

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生物小虫007

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4楼: Originally posted by xp198766 at 2018-04-17 17:14:22
看你的要求了，如果是想相对精确地知道里面有什么东西，做定性，可以使用你说的这种三代测序，特点是读长长，序列相对较少，贵；
如果想知道多样性，群落组成与变化，可以做16S/18S扩增子测序，PE250的hiseq或Mise ...

相比二代的16S扩增子测序，全长16S扩增子测序覆盖了全部的可变区域，从而实现了精确到“种”的分析鉴定，解决了二代测序针对局部可变区域分析的技术难题，即无法精确鉴定菌群