应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR反应条件的选择以及其反应的特点
61/1返回列表
查看: 2506  |  回复: 5
只看楼主@他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

xmc21xx

新虫 (初入文坛)
已领完
PCR反应条件的选择以及其反应的特点
领取红包 (小木虫手机app专属红包)

扫一扫，下载小木虫客户端

上海通晓生物技术有限公司成立于2016年，总部坐落于上海国际医学园区。是一家集精准医疗新技术研发、分子诊断产品转化、基因检测服务、细胞治疗、健康管理的高新技术企业，致力于将先进的基因组学技术、细胞治疗技术应用于临床实践，为医疗机构及大众提供基于分子诊断的全方位、个体化的精准医疗解决方案.
上海通晓生物技术有限公司拥有国际一流的技术平台，包括一代测序、二代测序、qpcr、ddpcr、液相芯片技术、FISH等技术平台。通晓生物下设医学检验所、细胞治疗中心、分子病理中心、健康管理中心、ivd研发中心。
PCR反应条件为温度、时间和循环次数。
温度与时间的设置： 基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40 ～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100～300bp时)可采用二温度点法， 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性)。
①变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性，若低于93℃则 需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。
②退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长 度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：
Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)
复性温度=Tm值-(5～10℃)
在Tm值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。
③延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性：
70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子
70℃ 60核苷酸/S/酶分子
55℃ 24核苷酸/S/酶分子
高于90℃时， DNA合成几乎不能进行。

PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够 的。3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。
循环次数 循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30～40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。

PCR反应特点
特异性强 PCR反应的特异性决定因素为：
①引物与模板DNA特异正确的结合；
②碱基配对原则；
③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；
④靶基因的特异性与保守性。
其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。
灵敏度高 PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12g)量级的起始待测模板扩增到微克(ug=10-6g)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位)；在细菌学中最小检出率为3个细菌。
简便、快速 PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2～4 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。
对标本的纯度要求低 不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。 PCR扩增产物分析
PCR产物是否为特异性扩增 ，其结果是否准确可靠，必须对其进行严格的分析与鉴定，才能得出正确的结论。PCR产物的分析，可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。
凝胶电泳分析：PCR产物电泳，EB溴乙锭染色紫外仪下观察，初步判断产物的特异性。PCR产物片段的大小应与预计的一致，特别是多重PCR，应用多对引物，其产物片断都应符合预讦的大小，这是起码条件。
琼脂糖凝胶电泳： 通常应用1～2%的琼脂糖凝胶，供检测用。
聚丙烯酰胺凝胶电泳：6～10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好，条带比较集中，可用于科研及检测分析。
酶切分析：根据PCR产物中限制性内切酶的位点，用相应的酶切、电泳分离后，获得符合理论的片段，此法既能进行产物的鉴定，又能对靶基因分型，还能进行变异性研究。
分子杂交

发自小木虫Android客户端
回复此楼

» 收录本帖的淘贴专辑推荐

PCR相关

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 抢金币啦！回帖就可以得到:

查看全部散金贴
1楼2018-04-10 16:30:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
简单回复
pandongzi2楼
2018-04-10 16:30   回复  
xmc21xx(金币+1): 谢谢参与
已获得1个金币 发自小木虫IOS客户端
xl00713343楼
2018-04-10 16:30   回复  
xmc21xx(金币+1): 谢谢参与
已获得1个金币 发自小木虫Android客户端
hdchina20104楼
2018-04-10 16:30   回复  
xmc21xx(金币+1): 谢谢参与
已获得1个金币 发自小木虫IOS客户端
jixiangbao5楼
2018-04-10 16:30   回复  
xmc21xx(金币+1): 谢谢参与
已获得1个金币 发自小木虫IOS客户端
真的蚁族6楼
2018-04-10 16:31   回复  
xmc21xx(金币+1): 谢谢参与
已获得1个金币 发自小木虫IOS客户端
相关版块跳转 我要订阅楼主 xmc21xx 的主题更新
61/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复(可上传附件) SCI英文润色翻译-EnPapers美团队-先修改后付款
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[教师之家] 双非本科，学生又懒又笨。双一流本科好一些？入职门槛和考核要求比双非本科高多少？ +5 河西夜郎 2024-05-05 5/250 2024-05-07 14:04 by 15512189958
[考研] 要不要二战？ +7 ajjznskk 2024-05-05 10/500 2024-05-07 13:09 by 煎饼果子007
[考研] 关于要不要三战 +9 煎饼果子007 2024-05-06 13/650 2024-05-07 11:03 by maolC
[有机交流] 液晶单体纯度为什么要求这么高。 +4 Jonessnow 2024-05-01 5/250 2024-05-07 10:47 by kangshisan
[有机交流] 酰胺合成 +3 Spiralup 2024-05-06 7/350 2024-05-07 09:35 by 88817753
[论文投稿] 审稿人一收一拒，编辑给了修 +10 njuyck 2024-04-30 23/1150 2024-05-07 09:27 by BusyGer
[高分子] 求推荐研究U V热熔胶的高手 +4 千年一虫 2024-05-04 4/200 2024-05-07 09:16 by Sunrisepay
[基金申请] 2024国家自然科学基金资助额度 +13 i6277 2024-05-05 14/700 2024-05-07 00:24 by dxcharlary
[基金申请] AI派发是根据关键词、基金题目、研究者研究方向匹配？ 200+3 flllgend 2024-05-04 10/500 2024-05-06 23:53 by dxcharlary
[考博] 考博求推荐24-25都行 +3 godweiliu 2024-05-01 5/250 2024-05-06 15:43 by 愿你快乐啊
[论文投稿] 数据共用 +4 Zzd-zzd 2024-05-06 4/200 2024-05-06 15:23 by topedit
[教师之家] 请教下各位，南京航空航天大学天目湖校区如何？ +3 pp爱写论文 2024-05-05 4/200 2024-05-06 14:59 by eseayl
[有机交流] 酯化和酯交换 40+4 whw818 2024-05-04 5/250 2024-05-06 14:24 by 世界之源
[硕博家园] 等盲审 +10 暮色恋伊人 2024-05-03 18/900 2024-05-06 11:44 by 暮色恋伊人
[考博] 25年春秋博士申请 +4 梦想研究生 2024-05-04 7/350 2024-05-06 11:24 by 梦想研究生
[基金申请] 多大算大龄？ +5 wyjecho666 2024-05-01 6/300 2024-05-06 11:06 by 梦想成真2014
[论文投稿] 想问下电池发在nano letters含金量高不高 +6 未来富婆蛙 2024-04-30 11/550 2024-05-05 10:53 by eemdl
[基金申请] 活页超过7000字，有影响吗？ +4 青竹82 2024-05-04 5/250 2024-05-04 23:28 by 华氏911.
[基金申请] 关于公布2024年度国家自然科学基金项目申请初审结果的通告 (金币+2) +12 hdzw9071 2024-04-30 18/900 2024-05-04 17:49 by felicity6056
[基金申请] 今年面上预计又打酱油了 +15 speedxyl 2024-04-30 17/850 2024-05-04 02:07 by jbb0523
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭