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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 层析/纯化 » 疏水纯化
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Super_yue

新虫 (初入文坛)

[交流] 疏水纯化 已有3人参与

前几天做了重组GFP的纯化，用的自己装的疏水柱，装了5ml,填料用的Phenyl FF（载量大约50mg/ml）,查了一篇文献，目的是想重复他们的实验，做出一样的结果，文献用的1ml预装柱，我是自己装的柱子，但是文献的样品蛋白中含量未知，我的实验只准备了大概1mg（可能不到）蛋白量的样品，平衡洗脱条件与buffer都与文献中一样，但是，最后实验没有做出来，洗脱过程中几乎没有峰，有那么一个也是响应值很低很低，而且峰型很丑，那个峰附近收集到的液体检测到了荧光，但是也是很低。洗脱完用平衡液平衡柱子的过程中，出来了两个峰，比洗脱过程的那个小峰响应值高，但是收集到的液体没有检测到荧光。请教大神们，我的实验出了什么问题？洗脱之后平衡阶段出来的俩峰是我的样品峰吗？我的样品中蛋白量是不是太低了？
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1楼 2018-04-09 14:40:17
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hc-material

专家顾问 (职业作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
洗脱后，在平衡，有可能是你要的样品，上样量太小了
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2楼2018-04-11 08:27:07
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Super_yue

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by hc-material at 2018-04-11 08:27:07
洗脱后，在平衡，有可能是你要的样品，上样量太小了

洗脱之后再平衡过程出来的峰可能是我的样品峰吗？可是没有检测到荧光啊
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3楼2018-04-11 15:16:40
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Super_yue

新虫 (初入文坛)
顶
4楼2018-04-11 15:21:48
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503276866

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
样品量太少了，响应很低，按理说平衡不应该是样品的，可能是一些杂质
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没有最好只有更好
5楼2018-04-16 09:21:26
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Super_yue

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 503276866 at 2018-04-16 09:21:26
样品量太少了，响应很低，按理说平衡不应该是样品的，可能是一些杂质

谢谢您！
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6楼2018-05-08 10:08:58
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walking dead

金虫 (小有名气)

填料制备和蛋白纯化专家
★
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首先要清楚不同的缓冲液作用是不一样的，你的平衡液是加盐的，破坏水化膜增强疏水作用使蛋白结合在柱子，是不会把结合的目的蛋白洗下来的。你洗脱出现了一个峰而且有紫外检测到，说明有洗脱到目的蛋白啊，就是你的样品太少，再加上上样后浓度过低，检测值肯定小啊，很正常。你后面的平衡洗下来的应该应该是杂蛋白。
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7楼2018-05-30 10:59:41
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Super_yue

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by walking dead at 2018-05-30 10:59:41
首先要清楚不同的缓冲液作用是不一样的，你的平衡液是加盐的，破坏水化膜增强疏水作用使蛋白结合在柱子，是不会把结合的目的蛋白洗下来的。你洗脱出现了一个峰而且有紫外检测到，说明有洗脱到目的蛋白啊，就是你的样 ...

感谢感谢！！！

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8楼2018-06-21 13:30:07
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