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oldtimeyoung木虫 (知名作家)
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[求助]
求教，如何将长基因片段（7200bp）连接平末端载体上？ 已有1人参与
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| 本人最近正在尝试将一个长度为7200bp的基因片段连接到平末端载体上。使用的平末端试剂盒为全式金的p-EASY Blunt cloning kit 试剂盒。多次连接均未成功（调整连接时间，改变插入片段和载体的比例）。有时连接出现少量菌斑，提取质粒大小不一，且均不正确。当pcr验证这些质粒时，却可以扩增到插入目的基因的部分片段，提示连接时插入片段出现降解断裂，导致连接仅仅连接了该基因的一部分。但是我连接前跑了电泳进行过验证，结果显示插入的目的基因为一条均一清晰的条带，酶切插入片段也可以得到正确的酶切产物，因此理论上讲连接时加入的基因片段是完整正确的。所以应当是连接的过程中，插入的目的基因在和平末端载体连接时不知道因为什么原因发生了降解。使用该试剂盒之前最大连接过5000bp的基因，并未遇到任何困难。不知道有没有哪位虫友连接过大小相似的基因，还望赐教。 |
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