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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 克隆错配，求助！
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sophiapipi

新虫 (初入文坛)

[求助] 克隆错配，求助！已有1人参与

从质粒上扩基因，质粒测序正确，克隆测序结果都有错配，多种高保真酶都试了。。。请各位大神指点迷津，不胜感谢！

@youlinglyw 发自小木虫Android客户端
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1楼2018-04-04 15:01:01
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感觉要延期哎

新虫 (小有名气)
是直接pcr结果送测么，双向测通了吗

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2楼2018-04-04 23:06:27
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drwhoknowss

荣誉版主 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
首先请验证 “质粒测序正确”。
高保真酶是必须的，PCR太长错误越多。
PCR时cycle不要太多
最后，多挑几个菌，如果以上都没问题，你总能找到没错配的。
当然以上假设没有引物设计等的低级失误
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Progress in science depends on new techniques, new discoveries and new ideas, probably in that order. -- Nobel laureate Sydney Brenner
3楼2018-04-04 23:53:14
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sophiapipi

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 感觉要延期哎 at 2018-04-04 23:06:27
是直接pcr结果送测么，双向测通了吗

送的质粒，每次错配的都不是一个地方，怀疑是不是这个基因对菌有毒性，正确的是不是都对菌致死。

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4楼2018-04-08 22:26:55
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sophiapipi

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by drwhoknowss at 2018-04-04 23:53:14
首先请验证 “质粒测序正确”。
高保真酶是必须的，PCR太长错误越多。
PCR时cycle不要太多
最后，多挑几个菌，如果以上都没问题，你总能找到没错配的。
当然以上假设没有引物设计等的低级失误

每次错配的不是一个地方。总共用了4种高保真酶，保真性越高，阳性率越低。是不是这个基因对菌有毒，正确的都对菌致死呢？如果是这样选什么样的感受态比较好呢？

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5楼2018-04-08 22:30:27
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sophiapipi

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by sophiapipi at 2018-04-08 22:30:27
每次错配的不是一个地方。总共用了4种高保真酶，保真性越高，阳性率越低。是不是这个基因对菌有毒，正确的都对菌致死呢？如果是这样选什么样的感受态比较好呢？
...

PCR30个循环，序列长1400bp

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6楼2018-04-08 22:31:25
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drwhoknowss

荣誉版主 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by sophiapipi at 2018-04-08 22:30:27
每次错配的不是一个地方。总共用了4种高保真酶，保真性越高，阳性率越低。是不是这个基因对菌有毒，正确的都对菌致死呢？如果是这样选什么样的感受态比较好呢？
...

有毒是有可能性的，不过一般的promoter都在细菌里不启动的。你把基因反向插入试试，或者换一个质粒
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Progress in science depends on new techniques, new discoveries and new ideas, probably in that order. -- Nobel laureate Sydney Brenner
7楼2018-04-09 02:19:14
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