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guoyingnba

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[资源] 【分享】微量热技术介绍-今天刚刚知道

微量热法(包括等温滴定量热和差示扫描量热)是近年来发展起来的一种研究生物热力学与生物动力学的重要结构生物学方法，它通过高灵敏度、高自动化的微量量热仪连续和准确地监测和记录一个变化过程的量热曲线，原位(in situ)、在线(on-line)和无损伤地同时提供热力学和动力学信息。
微量热法具有以下特点：
1.它不干扰蛋白质和核酸的生理功能，具有非特异性的独特优势，即对被研究蛋白质和核酸体系的溶剂性质、光谱性质和电学性质等没有任何限制条件。
2.样品用量小,方法灵敏度高，测量时不需要制成透明清澈的溶液。
3.量热实验完毕的样品未遭破坏，还可以进行后续生化分析。
4.微量热法缺乏特异性。但由于蛋白质和核酸本身具有特异性，因此这种非特异性方法有时可以得到用特异方法得不到的结果，这有助于发现新现象和新规律。
微量热法在生物大分子研究中的应用主要有：
1.酶促反应
2. 蛋白质去折叠/折叠
3.抗原-相互作用
4.分子伴侣-底物相互作用
5.药物-核酸相互作用

等温滴定量热法（Isothermal Titration Calorimetry，ITC）
实验是通过滴定反应物到含有反应所必须的另一反应物的样品溶液中。每次滴定后，反应热放出或吸收，这些都可以被ITC所检测到。检测到的热效应的热力学分析提供了结合反应相关的能量过程的定量特征，可以直接测量与常温下发生的反应过程相关的能量学参数。

1 ITC的特点
ITC能测量到的热效应最低可达125 nJ，最小可检测热功率2 nW，生物样品最小用量0.4 μg，而且这些年来ITC的灵敏度得到了提高，降低了响应时间（小于10 s）。ITC不需要固定或改变反应物，因为结合热的产生是自发的。
获得物质相互作用完整的热力学数据包括结合常数（Ka）、结合位点数（n），结合焓（△H）、恒压热容（△Cp）和动力学数据（如酶促反应的Km和kcat）。
ITC也比那些选择分析方式（如分析型超速离心法，AUC）快，一个单纯的AUC实验需要几个小时甚至几天去完成，而典型的ITC实验只需30~60分钟，在加上几分钟的响应时间。整个实验有计算机控制，使用者只需输入实验的参数（温度、注射次数、注射量等）计算机就可以完成整个实验，再由Origin分析ITC得到的数据。其精确度高以及操作简单。

2 ITC的应用
1）蛋白质-小分子和酶-抑制物相互作用；
2）蛋白质-糖类相互作用；
3）蛋白质-蛋白质相互作用：如Jacobson等用ITC研究了人细胞RNA聚合酶Ⅱ转录因子TFIID的最大亚单位TAFII250的组蛋白乙酰基转移酶活性(Jacobson et al., 2000)。日本Kanagawa科学技术研究所的Tahirov等利用ITC、CD和UV研究了AML1/Runx-1小结构域识别的DNA结构及CBFβ控制的构象调整，阐明了CBFβ与CBFα间的相互作用模式及前者调控后者结合到DNA上的机制(Tahirov, et al., 2001)。
3）蛋白质-脂质相互作用；
4）脂质间以及脂质-小分子相互作用；
5）核酸-小分子相互作用；
6）蛋白质-核酸相互作用；
7）核酸-核酸相互作用；
8）研究：美国Johns Hopkins大学生物系的生物量热学中心是目前世界上从事生物量热学最活跃和处于领先水平的实验室，该中心的Freire小组(Murphy et al., 1993, 1995)应用高灵敏度ITC分别研究了血管紧缩素与其单">和酸诱导去折叠细胞色素c与其单">抗体的结合，发现上述结合过程均为焓和熵同时驱动的反应，实验结果表明，这些过程中溶剂释放所导致的熵增过量补偿了因结合而引起的构象熵的损失。
9）受体相互作用；
10）蛋白质折叠和稳定性：如美国的Wright小组应用ITC和核磁共振(NMR)等技术研究了核激素受体蛋白的一个结构域与甲状腺素及类纤维素A受体相互作用的热力学，发现虽然分开的结构域本身很凌乱，但是它们之间有高的亲和力而且是焓驱动的，并以一种独特的协同折叠的机制形成螺旋异二聚体。
11）酶分析：如Freire小组应用等温滴定微量热法(ITC)结合高灵敏度差示扫描量热法(DSC)和分光光度法研究了细胞色素C氧化酶催化氧化其生理底物—亚铁细胞色素c的热力学和动力学，并分析了原盐效应对该酶活性的影响。我们应用等温微量热法研究了超氧化物歧化酶催化歧化超氧阴离子等反应体系，获得了这些酶促反应的各种热力学和动力学信息,探讨了相关催化机理，同时用该法研究了博莱霉素催化切割DNA的反应，从热力学和动力学的角度严格地证明了博莱霉素在催化机制上类似于DNA切割酶，但其催化效率低于DNA切割酶，并用等温滴定微量热法研究了不同浓度盐酸胍存在时肌酸激酶催化ATP与肌酸间转磷酸化反应的热力学，从热力学的观点确定了该酶促反应为快速平衡的随机顺序反应，还建立了新的肌酸激酶和超氧化物歧化酶活力测定方法—微量热测活法。
值得指出的是，ITC不仅被应用于研究蛋白质折叠/去折叠，而且被应用于核酸折叠，例如英国的Hammann等人利用ITC研究了镁离子诱导锤头状核酶折叠的热力学，发现镁离子与天然序列核酶的结合是一个强烈的放热反应，和镁离子与锤头状核酶不同序列变异体的结合有很大的区别，这些工作对于核酸折叠的热力学研究是良好的开端。

[ Last edited by zeoliters on 2009-11-15 at 22:49 ]

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