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slightshiner金虫 (正式写手)
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求dextran column的用途及原理
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| 近来要用dextran column,所以有此一问。想知道这种柱子主要是用来分离什么东东的，好像有的文献用它作为排阻色谱，但大多数时候用在生物样品分离上。哪位行家系统介绍一下，包括其原理，用途等，不胜感激。 |
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leonumn
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slightshiner(金币+6,VIP+0):thanks a lot. 3-17 21:03
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dextran 右旋糖苷 column : 不知道是不是手性柱? 如果是, 用于检测手性异构体 Cross-linked dextran : 交联葡聚糖凝胶, 用于排阻色谱 一、分离原理 排阻色谱法（SEC）亦称空间排阻色谱或凝胶渗透色谱法。是一种根据试样分子的尺寸进行分离的色谱技术。 排阻色谱的分离机理是立体排阻，样品组分与固定相之间不存在相互作用的现象。色谱柱的填料是凝胶，它是一种表面惰性，含有许多不同尺寸的孔穴或立体网状物质。凝胶的孔穴大小与被分离的试样大小相当。仅允许直径小于孔开度的组分分子进入，这些孔对于流动相分子来说是相当大的，以致流动相分子可以自由地扩散出人。对不同大小的组分分子，可分别渗入到凝胶孔内的不同深度，大个的组分分子可以渗入到凝胶的大孔内，但进不了小孔，甚至于完全被排斥。小个的组分分子，大孔小孔都可以渗进去，甚至进入很深，一时不易洗脱出来。因此，大的组分分子在色谱柱中停留时间较短，很快被洗出，它的洗脱体积（即保留时间）很小。小的组分分子在色谱柱中停留时间较长，洗脱体积卿保留时间）较大，直到所有孔内的最小分子到达柱出口，这种按分子大小而分离的洗脱过程才告完成。 因为分子尺寸一般随分子量的增加而增大，所以根据分子量表达分子尺寸比较方便。将因分子过大而不能部分地进入某一给走固定相孔内的最小的样品粒子的分子量，定义为该固定相的排阻极限。如图13-10中A点所相应的相对分子质量（这里，相对分子质量相当于），凡是比A点相应的相对分子质量大的分子，均被排斥于所有的胶孔之外，因而它们将以一个单一的谱带C出现，在保留体积V0时一起被洗脱。 很明显，V0 是柱中凝胶颗粒之间的体积。随固定相不同，排阻极限范围约在 400至60 X 106之间。将能够完全进入固定格最小孔内的最大的样品粒子的相对分子质量定义为填料的渗透极限。如图14-10中B点所相应的相对分子质量（这里相对分子质量为）。凡是比B点相应的相对分子质量小的分子都可以完全渗入凝胶孔穴中。同理这些化合物也将以一个单一谱带F在保留体积Vt被洗脱。 可以预料，相对分子质量介于上述两个极限之间的化合物，将根据它们的分子尺寸，进入一部分孔隙，而不能进入另一部分孔隙，其结果使这些化合物按相对分子质量降低的次序被洗脱。所以，在选择固定相时，应使欲分离样品粒子的相对分子质量落在固定相的渗透极限和排阻极限之间。由色谱过程的基本方程式可得： VR=V0+KSECVi （13-5）式中VR为保留体积（溶质洗脱体积），Vt为凝胶颗粒之间的体积（也称为间隙体积）；Vi为凝胶内孔体积，也即溶质分子能够渗透过去的那部分体积（也称为总孔容积）；Ksec为排阻色谱的分配系数，所以，Ksec被定义为溶质分子渗入内孔体积的分数，其数值在0～1之间，其值取决于组分分子的大小。对于完全不能进入凝胶孔内的大分子（即大于排阻极限的物质），其分配系数为零，即 Ksec一Cs/Cm=O，则VR=VO；对于能自由出入凝胶孔的小分子，其在固定相内部的浓度与在固定相外部的浓度相同，则Ksec=l，即VR=V0＋Vi因此所有组分只能在VO和VO＋Vi的洗脱体积之间被依次洗脱下来，不会超越这个界限。 同时还可以看出，柱子的间隙体积V0可通过测量相对分子质量大于固定相排阻极限的物质的保留体积而决定；对于已知V。的柱子，其固定相体积（总孔容积）可通过测量相对分子质量小于固定相渗透极限的物质的保留体积而决定。因为该物质KSEC为l，VR和V0已知，所以利用式（13-6）可计算Vi。能够部分进入固定相孔内的物质其分配系数一定在0与1之间，可通过把物质的Vi，V0和保留体积代人式（13-6）而求出。 例13-1 一相对分子质量为80000的分子通过一根填有排阻极限为40 000的固定相的柱子，保留体积为25 mL。另一足够小而能完全进入固定相孔内的低相对分子质量化合物的保留体积为 125 mL。样品组分的保留体积为102mL，计算间隙体积V0，总孔容积Vi及样品组分的分配系数。 排阻色谱法中，保留时间是分子尺寸的函数，因此有可能提供分子结构的某些信息。它主要用来获得分散性聚合物的相对分子质量分布情况。但它不能分辨分子大小相近的化合物。一般说来，分子量的差别需在10％以上时才能得到分离，所以该法不能用于分离复杂的混合物。 二、排阻色谱的填料和流动相 排阻色谱分离的基础是不同分子大小的组分进人填料内孔深度的不同。因此，选择和搭配具有不同孔径，色谱性能良好的填料是很重要的，填料孔径大小应与试样分子量的大小相适应。 根据填料的来源不同，可分为有机和无机填料两大类。前者如交联聚苯乙烯凝胶，后者如多孔硅胶和多孔玻璃等。交联聚苯乙烯凝胶是目前使用最多的一种填料，用它装填的色谱柱渗透性好，柱效高，但不宜长期在高温条件下使用。硅胶、多孔玻璃等无机填料，耐高温、机械性能稳定，但它们的共同缺点是其表面的吸附物性，由于表面的剩余羟基产生的活性中心，对一些极性物质有吸附作用，因而扰乱了排阻色谱分离的机理，这就要求完全的化学硅烷化处理，以消除表面残留羟基的影响。 在排阻色谱中使用的流动相，仅仅作为试样的载体而不应与试样本身或填料有任何的相互作用，即不存在吸附或分配作用，以免出现假性分子量的保留值。此外，还要求能完全溶解试样，在分离温下粘度底，其沸点通常不柱温高20～50℃，与检测器匹配等。常用的流动相有：四氢呋喃、十氢化萘、氯仿、二甲基甲酰胺等。 三、应用 排阻色谱主要被用与分离大分子物质，其分离范围从相对分子质量2000～2000000之间，这些物质大多是生物化学物质和聚合物等。此外，排阻色谱越来越多的应用是通过测量相对分子质量分布来鉴定高聚物及研究高聚物聚合机理、聚合工艺、条件等。 |
2楼2009-03-17 11:01:14
slightshiner
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