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求助：关于双酶切后的连接问题
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各位大侠：我最近在做外源基因的PCDNA3.1的载体构建，我用BamH 1和Xhol 酶切目的片段和PCDNA3.1载体后，用T4 连接酶进行连接，22摄氏度反应10min（按照连接酶的使用说明书操作）后电泳检测，在琼脂糖凝胶上什么也没有，这是什么原因呢？即使连不上，我的片段应该也会跑出来啊？我的片段跑哪儿去了呢？恳请各位大侠给予指点，不胜感激！ 细节：我用的20uL的连接体系。1ul酶，2ul 10Xbuffer，9uL基因片段，8uL酶切载体片段，22°C，10min。在连接前，我电泳检测过基因片段和载体片段6uL上样，条带很清楚；同时对载体进行过单酶切试验，电泳检测酶切后片段滞后，说明单酶切已经将载体切开，外源基因我是直接从质粒上双酶切下来，切胶回收的，我觉得应该不存在没有切开的问题。 |
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