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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求助：关于双酶切后的连接问题
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大力水手8608

新虫 (初入文坛)

[交流] 求助：关于双酶切后的连接问题

各位大侠：我最近在做外源基因的PCDNA3.1的载体构建，我用BamH 1和Xhol 酶切目的片段和PCDNA3.1载体后，用T4 连接酶进行连接，22摄氏度反应10min（按照连接酶的使用说明书操作）后电泳检测，在琼脂糖凝胶上什么也没有，这是什么原因呢？即使连不上，我的片段应该也会跑出来啊？我的片段跑哪儿去了呢？恳请各位大侠给予指点，不胜感激！
细节：我用的20uL的连接体系。1ul酶，2ul 10Xbuffer，9uL基因片段，8uL酶切载体片段，22°C，10min。在连接前，我电泳检测过基因片段和载体片段6uL上样，条带很清楚；同时对载体进行过单酶切试验，电泳检测酶切后片段滞后，说明单酶切已经将载体切开，外源基因我是直接从质粒上双酶切下来，切胶回收的，我觉得应该不存在没有切开的问题。
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1楼 2009-03-17 00:03:34
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zhaocy8903

木虫 (知名作家)
连接体系跑电泳看不到带正常，直接转化就是了
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2楼2009-03-17 08:14:47
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wjswj

木虫 (正式写手)

小木虫领金币专业户
载体是双切回收的吗？回收后跑电泳还能看到吗？拿链接产物来跑电泳，还真是奢侈啊。说明书上应该没有要求你连接好后去跑电泳看看。计算好连接体系中外源片段和载体的比例和适当的浓度，连接后直接转化就好了。连接成不成功看转化后克隆子的筛选就好。
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金币是赌出来的
3楼2009-03-17 09:07:15
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ypng

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by wjswj at 2009-3-17 09:07:
载体是双切回收的吗？回收后跑电泳还能看到吗？拿链接产物来跑电泳，还真是奢侈啊。说明书上应该没有要求你连接好后去跑电泳看看。计算好连接体系中外源片段和载体的比例和适当的浓度，连接后直接转化就好了。连接 ...

正如2楼所说，一般都是连接后马上转化，转化后才摇菌培养提质粒酶切验证，你是不是搞错了？连接后就是环状，比你的先前的片段跑得快啊，晕死！
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4楼2009-03-17 11:27:15
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大力水手8608

新虫 (初入文坛)
以前直接转化，总是不成功！没有转化子长出。我觉得这么高浓度的目的片段和载体片段，即使没有连接上也应该有条带出现啊？
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5楼2009-03-17 22:04:32
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bone0611

“同时对载体进行过单酶切试验，电泳检测酶切后片段滞后，说明单酶切已经将载体切开”
什么意思啊？你不是双酶切连接吗？那干嘛载体用单酶切呢？
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6楼2009-03-17 22:49:38
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huhu2182

新虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
我觉得连接上的质粒和片段毕竟是少数，跑电泳如果能看到，那么环化得质粒浓度该有多高的浓度啊，转化时肯定能成功的，所以转化不能成功可能还是你的板或者是之前酶切操作或是连接酶的问题，还有要在转化时做个不加入目的片段只加酶切后载体的连接体系做为负对照，看是不是你的酶切效果（如果转化的板上得到了很多克隆，说明你的酶切效果很差，得到的是单酶切产物或是未切开的产物）
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7楼2009-12-21 14:37:26
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bioxixi

木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
首先，我不明白楼主连接后跑胶的目的，是想检测什么吗？
另外，个人觉得9uL基因片段，8uL酶切载体片段的比例不是很合适，当让我不知道两者的浓度如何，但是据经验载体的浓度应该也蛮大的，加8uL酶切载体片段会不会太多了。
再就是觉得连接成功的应该是少数，应该能看到酶切片段的，至于有什么因素影响了电泳我也不是很清楚
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8楼2009-12-21 15:49:22
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