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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物化学 » 请教大家小鼠肝脏组织Western blot的实验方法
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果果gxl2013

金虫 (小有名气)

[交流] 请教大家小鼠肝脏组织Western blot的实验方法

本人最近在做小鼠肝脏组织Western blot，RIPA裂解液，加PMSF，匀浆后14000r/min离心20分钟，取上清（尽量避开透明胶状粘液）。BCA法定量后加SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，沸水浴5分钟变性。冷却后-80度保存。跑胶后发现约85KD的LRP1蛋白正常表达，而beta-actin（Santa）却怎么都不出。或者偶尔出2-3个孔（大部分时候都没有条带）。这个actin一抗我们实验室已经连续购买多次了都没有问题，并且其他同学使用相同抗体的实验结果（包括组织和细胞）都很正常，有同学做肾脏组织的也是正常出条带。唯独到我的肝脏组织就没有条带。请问哪位大侠有好的解决办法啊？不胜感激
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1楼 2018-03-19 14:46:02
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star013

新虫 (知名作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我们可以做wb技术服务

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2楼2018-03-19 15:56:25
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drwhoknowss

荣誉版主 (正式写手)
★ ★
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果果gxl2013: 金币+1 2018-03-20 10:30:28
你上传一张blot的照片看看？
另外多用些抗体试试
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Progress in science depends on new techniques, new discoveries and new ideas, probably in that order. -- Nobel laureate Sydney Brenner
3楼2018-03-19 21:46:15
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二七度の風

新虫 (初入文坛)
★ ★
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果果gxl2013: 金币+1 2018-03-20 10:30:20
这个好奇怪，动物组织你可以试试用GAPDH作内参试试

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4楼2018-03-20 00:14:42
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果果gxl2013

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 二七度の風 at 2018-03-20 00:14:42
这个好奇怪，动物组织你可以试试用GAPDH作内参试试

嗯嗯，今天试试GAPDH吧。谢谢
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5楼2018-03-20 10:30:15
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小莉露@

新虫 (初入文坛)
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5楼: Originally posted by 果果gxl2013 at 2018-03-20 10:30:15
嗯嗯，今天试试GAPDH吧。谢谢...

请问 gadph做出来怎么样

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6楼2018-04-02 15:25:43
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轻易不説

新虫 (初入文坛)
★
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提蛋白的时候研磨充分么？有没有用液氮研磨？

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新人报到，多多关照
7楼2018-04-02 18:19:42
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果果gxl2013

金虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 轻易不説 at 2018-04-02 18:19:42
提蛋白的时候研磨充分么？有没有用液氮研磨？

用液氮怎么研磨呀？我都是机械研磨的，肉眼没有看到渣滓。谢谢！
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8楼2018-04-03 08:46:01
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果果gxl2013

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 小莉露@ at 2018-04-02 15:25:43
请问 gadph做出来怎么样
...

出来了，但我降低上样量约到8微克，压2小时出actin，它俩趋势不同...
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9楼2018-04-03 08:48:29
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轻易不説

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
如果只是机械研磨可能只研磨碎了一部分细胞。液氮研磨就是先在研钵机械研钵，然后倒入液氮，会结冰，然后再继续研磨。液氮温度很低，细胞内水分结冰体积变大，可以撑破细胞膜或者细胞壁，有利于提取蛋白。

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新人报到，多多关照
10楼2018-04-03 09:29:34
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