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bunnywkch

银虫 (小有名气)


[交流] {求助}如何确定表达产物是否在体内形成包涵体

一个重组质粒携带目标基因在大肠杆菌中得到了表达,表达产物是胞内酶,破壁提取之后测定的也有酶活,但是看到书上说胞内酶如果处于周质空间很容易形成包涵体,并且在原核中表达,酶的空间折叠是不固定的。我就比较担心我的酶是否会形成了包涵体?酶的折叠会不会变化?我提到的酶活性会不会消失?我属于刚入行的新手,对整体了解的都比较有限,还请大家多多指教!!!
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winter_gates

金虫 (正式写手)

生命过客

简单,诱导表达后超声破碎,取破碎后液体一部分,将剩余部分离心,取同体积的上清液。同时跑SDS-PAGE,比较前后目的条带,如果之前的目的条带亮度高于离心后,那么就是有包涵体。
For my life!
4楼2009-03-13 22:13:57
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zhaocy8903

木虫 (知名作家)


sutao1979(金币+1,VIP+0):谢谢参与 3-13 21:54
离心,看你的酶是在上清还是在沉淀中
另外,测定酶活时要考虑特异性
2楼2009-03-13 16:36:13
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sutao1979

木虫 (著名写手)

小木虫10年groupleader

这个比较麻烦,通常在37度,高速震荡培养的条件下表达的蛋白都是包涵体蛋白
你也可以做实验检测一下,分别检测裂解上清,过柱液体,和纯化之后的液体看看哪个液体里蛋白含量高,来确定采用那种蛋白提取方法
会当凌绝顶,一览众山小
3楼2009-03-13 21:58:42
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finding1371

银虫 (小有名气)

将目的蛋白初步纯化,做个底物转化实验也行啊
5楼2009-03-13 23:02:17
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