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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » RT-PCR
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亦木水

铜虫 (小有名气)
谢谢几位的意见啊，我下周再做试试，bless me !
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11楼2009-03-20 22:02:42
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亦木水

铜虫 (小有名气)

终于有结果了

周一重新做的，提取RNA前用蜗牛酶破壁了一个小时，用TAKARA的RNAiso试剂提的。做RTPCR买的是TAKARA的KIT（AMV.Ver.3.0），第一步反转录反应时，先加RNA和Oligo（dT）引物，60°水浴了5分钟，然后冰浴终止，然后是按照操作说明加入其他试剂反应。第二步PCR反应就按说明来做的。
PCR结果比第一次好的多了，至少这次一眼能看出来，不像上面的图还要仔细找。当晚把胶回收了。
周二用胶回收的PCR产物和PCR反应液做PCR，这次我用了PCR MASTER和上面KIT里带的两种酶做的，共四个样。做出来结果不错。用胶回收的产物做出的亮度很高，用PCR反应液做的也有目的条带，只是暗点。两种酶比较下来，还是KIT里带的那个酶强。晚上回收了两个样，做T载体连接。

终于把RTPCR这个坎迈过了，上学期期末就开始做了，筛酵母，破壁，PCR，每个环节都花了很多时间。下面连接转化，构建酵母表达系统估计也是长路漫漫。
虫友们一起加油！
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12楼2009-03-25 10:01:52
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x8q4h11

木虫 (小有名气)
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Originally posted by 亦木水 at 2009-3-25 10:01:
周一重新做的，提取RNA前用蜗牛酶破壁了一个小时，用TAKARA的RNAiso试剂提的。做RTPCR买的是TAKARA的KIT（AMV.Ver.3.0），第一步反转录反应时，先加RNA和Oligo（dT）引物，60°水浴了5分钟，然后冰浴终止，然后是 ...

你好，我想问一下你用PCR回收产物做PCr时，模板加多少？谢谢
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13楼2009-04-21 19:36:09
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亦木水

铜虫 (小有名气)
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Originally posted by x8q4h11 at 2009-4-21 19:36:

你好，我想问一下你用PCR回收产物做PCr时，模板加多少？谢谢

我加2ul
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14楼2009-04-23 12:37:34
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x8q4h11

木虫 (小有名气)
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Originally posted by 亦木水 at 2009-4-23 12:37:


我加2ul

谢谢。还想问一下，你是使用50微升体系，直接加2微升回收产物做模板吗？不用稀释吗？
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15楼2009-04-23 21:26:46
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亦木水

铜虫 (小有名气)
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Originally posted by x8q4h11 at 2009-4-23 21:26:

谢谢。还想问一下，你是使用50微升体系，直接加2微升回收产物做模板吗？不用稀释吗？

回收的产物浓度不高的啊，我的体系是25ul的
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16楼2009-04-24 21:14:29
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x8q4h11

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 亦木水 at 2009-4-24 21:14:


回收的产物浓度不高的啊，我的体系是25ul的

谢谢
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17楼2009-04-25 10:40:28
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