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亦木水

铜虫 (小有名气)

谢谢几位的意见啊,我下周再做试试,bless me !
11楼2009-03-20 22:02:42
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亦木水

铜虫 (小有名气)

终于有结果了

周一重新做的,提取RNA前用蜗牛酶破壁了一个小时,用TAKARA的RNAiso试剂提的。做RTPCR买的是TAKARA的KIT(AMV.Ver.3.0),第一步反转录反应时,先加RNA和Oligo(dT)引物,60°水浴了5分钟,然后冰浴终止,然后是按照操作说明加入其他试剂反应。第二步PCR反应就按说明来做的。
PCR结果比第一次好的多了,至少这次一眼能看出来,不像上面的图还要仔细找。当晚把胶回收了。
周二用胶回收的PCR产物和PCR反应液做PCR,这次我用了PCR MASTER和上面KIT里带的两种酶做的,共四个样。做出来结果不错。用胶回收的产物做出的亮度很高,用PCR反应液做的也有目的条带,只是暗点。两种酶比较下来,还是KIT里带的那个酶强。晚上回收了两个样,做T载体连接。

终于把RTPCR这个坎迈过了,上学期期末就开始做了,筛酵母,破壁,PCR,每个环节都花了很多时间。下面连接转化,构建酵母表达系统估计也是长路漫漫。
虫友们一起加油!
12楼2009-03-25 10:01:52
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x8q4h11

木虫 (小有名气)

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Originally posted by 亦木水 at 2009-3-25 10:01:
周一重新做的,提取RNA前用蜗牛酶破壁了一个小时,用TAKARA的RNAiso试剂提的。做RTPCR买的是TAKARA的KIT(AMV.Ver.3.0),第一步反转录反应时,先加RNA和Oligo(dT)引物,60°水浴了5分钟,然后冰浴终止,然后是 ...

你好,我想问一下你用PCR回收产物做PCr时,模板加多少?谢谢
13楼2009-04-21 19:36:09
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亦木水

铜虫 (小有名气)

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Originally posted by x8q4h11 at 2009-4-21 19:36:

你好,我想问一下你用PCR回收产物做PCr时,模板加多少?谢谢

我加2ul
14楼2009-04-23 12:37:34
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x8q4h11

木虫 (小有名气)

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Originally posted by 亦木水 at 2009-4-23 12:37:


我加2ul

谢谢。还想问一下,你是使用50微升体系,直接加2微升回收产物做模板吗?不用稀释吗?
15楼2009-04-23 21:26:46
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亦木水

铜虫 (小有名气)

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Originally posted by x8q4h11 at 2009-4-23 21:26:

谢谢。还想问一下,你是使用50微升体系,直接加2微升回收产物做模板吗?不用稀释吗?

回收的产物浓度不高的啊,我的体系是25ul的
16楼2009-04-24 21:14:29
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x8q4h11

木虫 (小有名气)

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Originally posted by 亦木水 at 2009-4-24 21:14:


回收的产物浓度不高的啊,我的体系是25ul的

谢谢
17楼2009-04-25 10:40:28
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