| 查看: 1944 | 回复: 6 | |||
[交流]
十招搞定免疫荧光 已有3人参与
|
|
免疫荧光是标记免疫技术发展最早的一种，它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术，通过将抗体与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。免疫荧光步骤包括，细胞固定和通透，封闭，孵育一抗，二抗等。除了这些基本步骤，以下建议可以帮助您获得更好的实验结果。 1细胞固定和通透 为达到最佳的检测效果，细胞需要经过固定和通透。这些步骤非常关键，细胞和抗原需要保证最佳的结构，并利于抗体与抗原结合。通常情况下，需要通过以下步骤得以实现：细胞用2%-4%多聚甲醛固定，之后用0.1%皂角苷或0.02%的Triton X-100进行通透。前者是比较温柔的处理，但是对于核内抗原可能无效，需要用到Triton。使用皂角苷进行通透时，要注意它会引起细胞膜的可逆性通透，也就是除了在通透初期，在每个抗体孵育环节都需要进行通透。另外，细胞可以用冰甲醇进行同时固定和通透，可以避免去垢剂的使用。 2抗体特异性 免疫荧光需要用到特异性非常强的抗体，可以避免高背景和不理想的蛋白定位结果。在大多数情况下，纯化抗体的效果很好，但是正确的对照可以帮助精准定位抗原。使用只有二抗染色的片子作为阴性对照，有利于减少降低背景干扰。 3合适的抗体稀释比例 通过优化抗体稀释比例来优化染色，通常情况下1ug/ml的纯化抗体或者1:100-1:1000的抗血清足够达到特异性染色的结果。但在能保证低背景染色的前提下，可以通过增加浓度来提高信号强度。如果是第一次使用该抗体或测定某抗原，强烈建议浓度梯度实验。 4优化缓冲液和封闭液 尽管很多抗原在常见的Buffer如PBS中可以很好的被染色，但是对于某些目的抗原，更换一下含有不同离子的缓冲液，比如钙、镁、钾等，可以带来很大程度上的改善。Rockland可提供优化过的IHC用封闭缓冲液，同样适用于荧光染色实验。 5选择正确的二抗 如果您需要做免疫实验，我们强烈建议您选择进行过预吸附的二抗进行单染实验；如果是双重甚至是多重染色，那么必须使用预吸附的二抗。同时，请优先选择来自同一物种的二抗。 6使用合适的细胞密度 选择合适的细胞数量进行染色，当细胞数量过多时，细胞结构不好，导致染色背景深，低细胞密度，会使细胞贴壁不佳，状态不好。 7多重染色 对同一样本进行两个不同抗原的检测时，可以用各自的抗体进行同时染色，但要求两个一抗的种属来源不同，标记物不同，而二抗的种属来源需保持一致。 8降低背景 高背景是免疫荧光常见的问题，解决此问题可以用二抗来源的正常血清代替BSA做封闭液，降低抗体浓度，增加洗涤次数，洗涤至少三次，每次五分钟，推荐洗涤液为PBS+0.05%Tween。 9封片 作为免疫荧光的最后一步，可以提高折射率，保护样品。 10数据分析 观察整体样片时，选择具有代表性的细胞进行数据获取与分析。 |
回复此楼» 本帖已获得的红花（最新10朵）
cc19930301» 猜你喜欢
计算机、0854电子信息（085401-058412）调剂
已经有5人回复
-
国自然申请面上模板最新2026版出了吗？
已经有13人回复
-
基金委咋了？2026年的指南还没有出来？
已经有3人回复
-
Materials Today Chemistry审稿周期
已经有5人回复
-
溴的反应液脱色
已经有7人回复
-
推荐一本书
已经有12人回复
-
基金申报
已经有4人回复
-
纳米粒子粒径的测量
已经有7人回复
-
常年博士招收(双一流，工科)
已经有4人回复
-
有没有人能给点建议
已经有5人回复
jinkairui123
铁虫 (正式写手)
- 应助: 35 (小学生)
- 金币: 394.7
- 散金: 75
- 红花: 2
- 帖子: 313
- 在线: 63.4小时
- 虫号: 4843007
- 注册: 2016-07-15
- 专业: 蛋白质组学
2楼2018-03-02 15:35:00
 |
3楼2018-03-02 16:28:46
cc19930301
新虫 (小有名气)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 37.9
- 散金: 5
- 帖子: 85
- 在线: 20.9小时
- 虫号: 3310700
- 注册: 2014-07-07
- 性别: GG
- 专业: 血液系统
4楼2018-03-12 21:57:18
5楼2018-03-13 13:49:38
kanerea
新虫 (小有名气)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 253.1
- 散金: 50
- 帖子: 72
- 在线: 6.4小时
- 虫号: 7192873
- 注册: 2017-09-16
- 专业: 神经系统肿瘤（含特殊感受
6楼2018-03-13 23:04:43
7楼2018-03-16 15:37:42