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bioconnor金虫 (正式写手)
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关于生物发光的问题。
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| 请教各位大侠，谁知道生物发光的 主要原理 和类型吗？ 在这方面有没有什么应用？ 另外， 特别是发光菌，可不可以解释一下发光机理？ |
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2楼2009-07-29 10:48:40
3楼2009-07-29 10:49:22
hyde0706
木虫 (正式写手)
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ligl234
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绿色荧光蛋白的应用
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绿色荧光蛋白的应用 2008年10月8日，三位美国科学家——伍兹霍尔海洋生物学实验室（Woods Hole Marine Biological Laboratory, MBL）的Osamu Shimomura、哥伦比亚大学（Columbia University）的Martin Chalfie以及加州大学圣地亚哥分校（University of California, San Diego）的钱永健（Roger Yonchien Tsien），因在研究和发现绿色荧光蛋白（green fluorescent protein, GFP）方面做出突出贡献而获得诺贝尔化学奖。 一、 GFP背景概述 绿色荧光蛋白（green fluorescent protein, GFP）最早由Osamu Shimomura于1962年在水母（Aequorea victoria中发现。这种蛋白质在蓝色波长范围的光照激发下发出绿色荧光，其发光过程需要冷光蛋白质Aequorin的帮助，而且，这个冷光蛋白质可与钙离子（Ca2+）相互作用。在Aequorea victoria中发现的野生型绿色荧光蛋白的分子量较小，仅为27~30kDa，而编码GFP的基因序列也很短，为2.6kb。 二 GFP在生命科学研究中的应用 1. GFP在蛋白质相互作用研究中的应用 在活体内检测蛋白与蛋白相互作用，对我们理解生物学过程至关重要。研究蛋白质相互作用的经典技术是酵母双杂交系统。它是一个基于转录因子模块结构的遗传学方法，由Fields和Song等人于1989年首次建立，随后在蛋白相互作用研究领域广泛应用。酵母双杂交系统的实验过程，就是将已知蛋白作为诱饵蛋白，在系统中捕获与其相互作用的蛋白质。来源于水母的GFP在此系统中得到了广泛应用，人们可用它直接监测蛋白质与蛋白质的相互作用。 科学家利用两个增强型GFP（EGFP）片段重建功能，从而开发出一种新型的报告系统以应用于酵母双杂交系统。该系统在基因水平上将EGFP片段分别与诱饵蛋白及要捕获的蛋白融合，在体内共表达，从而研究蛋白与蛋白间的相互作用。与现有的酵母双杂交系统相比，EGFP系统中的诱饵、靶蛋白载体的报告基因和复制控制元件均得到了改进。在酵母中，当蛋白与蛋白发生相互作用时，分开的EGFP能够重新结合而发出荧光。 1.1 构建分离的EGFP报告质粒 以分离的EGFP作为酵母双杂交系统的报告基因有明显的优势，因为它不需要外源底物及辅助因子就能发出荧光。从理论上讲，该报告系统的基础是酵母中蛋白与蛋白间发生相互作用后，被分开的荧光蛋白片段会再次互相结合从而发出荧光。EGFP报告质粒包括pNEGFP和pCEGFP。构建模式见图8。 在乙醇脱氢酶1（ADH1）启动子控制下，诱饵蛋白质粒编码的EGFP N-末端（NEGFP, 1-158位氨基酸）及靶蛋白质粒编码的EGFP C-末端（CEGFP, 159-239位氨基酸）能够被组成型表达，其转录被ADH1终止子序列终止。 构建的EGFP报告质粒pNEGFP和pCEGFP分别为色氨酸和亮氨酸选择性，并且它们都是携带有低拷贝数起始位点（CEN6/ARS4起始位点）的着丝粒质粒。这些低拷贝数的质粒降低了蛋白表达水平，从而解决了酵母细胞中的蛋白毒性问题。为了克隆操作的方便，在质粒的多克隆位点（MCS）还引入了BamH I、Sal I及Pst I等其它克隆位点。另外，为了评价周围的结构域会否会产生空间位阻效应，研究人员还分析了由多种不同方法构建的EGFP报告系统，进行构象优化。 下文将以酵母GAL4DD与GAL11P的相互作用为例，说明该系统的功能。 1.2 以分离的EGFP为报告系统的酵母双杂交系统 为了验证当酵母中的蛋白间发生相互作用时，被分离的EGFP会互补结合，研究人员以GAL4DD作为诱饵蛋白，GAL11P作为靶蛋白进行了实验。在蛋白与蛋白相互作用的研究中，经常使用这两种蛋白作为对照。实验中，研究人员将含有GAL11P的pCEGFP质粒（pCEGFP:GAL11P）与包含GAL4DD的pNEGFP:GAL4DD质粒一起转入酵母细胞，这样酵母就会含有pCEGFP:GAL11P和pNEGFP:GAL4DD两个质粒，这两个质粒均可用于研究荧光重建。另外，由于EGFP片段（NEGFP和CEGFP）的空间位阻效应可能会影响到荧光发色基团的形成，为了确定合适的融合蛋白空间结构，研究人员构建了不同组合的EGFP报告质粒，它们能够表达不同的EGFP片段组合。 2. GFP在转基因动物研究中的应用 由于GFP自身的特点，它能够在体内或体外进行实时监测。GFP还有另一个优势，能采用流式细胞仪、共聚焦显微镜及荧光计等技术进行定量检测。目前，人们已经改进了野生型GFP基因，从中获得的几种变体在热稳定性和荧光强度等方面都有所增强。增强型GFP（EGFP）就是其中之一。现在，它已普遍应用于转基因或基因打靶小鼠。更为重要的是，人们现在已经开发出多种GFP光谱变体，其中两种全新颜色的变体——增强型黄色荧光蛋白（EYFP）和增强型蓝绿色荧光蛋白（enhanced cyan fluorescent protein, ECFP）已应用于小鼠研究中。 由于ECFP和EYFP的谱线轮廓截然不同且没有重叠，所以这两种荧光蛋白可同时用作报告基因并共同显色，这对体内双标记或荧光能量转移分析等研究是非常理想的。GFP及其颜色变体作为报告蛋白的应用为科学研究提供了一个空前的高精度检测方法，代表着小鼠基因组改造技术的未来发展方向，并开启了在同一个动物体内应用组合无创性报告基因的广阔前景。 2.1 基因打靶和胚胎干细胞（ES）技术 基因打靶和胚胎干细胞技术的出现为小鼠基因组操作引进了新的方法。胚胎干细胞是来源于后胚泡期胚胎的多能干细胞系，经体外繁殖和处理后可再导入胚胎。自人们从胚胎干细胞克隆出小鼠生殖细胞，并证明将亲本的基因组传递给后代后，胚胎干细胞就成为常用的工具。现在，只要在体外进行基因打靶和转基因操作，就可通过生殖细胞将亲本的基因组传递给后代。 2.1.1 报告系统 一直以来，追踪研究发育及疾病过程中细胞的命运、迁移和增殖等的变化都是一种挑战。研究人员会使用不同的标签基因来追踪不同成分，尤其在基因突变（敲除）动物中得到广泛的应用。LacZ是常用的嵌合体突变标签，而另一个报告基因则是人胎盘碱性磷酸酶（hPLAP）。但是，它们都需要通过样本固定过程和经酶显色反应。而荧光蛋白（fluorescent protein, FP）报告基因则比酶类报告基因有优势，它们可定量、无需实验样品处理并且是无创的。多年来，多种外源荧光染料，如DiI或DiO的应用已经证明它们在荧光标记中的作用。但是，由于它们不是基因水平上的标记，观察的窗口期很短，而且不能向下遗传，所以无法应用于基因打靶和转基因动物。1992年，人们首次克隆出GFP，并随后在线虫中表达GFP并检测到荧光，从而确立了新型GFP基因报告系统。 2.1.2 GFP——一个出众的荧光蛋白报告分子 在生物发光水母Aequorea victoria体内，当能量从钙激活的发光蛋白转移至GFP时就会发光。GFP可在不同的系统中表达，当受到适当波长的光（主峰在400nm附近，次峰在470nm附近）激发后，GFP就会发出绿色荧光并在505nm附近达到高峰。研究人员已经证实这种发光蛋白被激发后发出荧光是种属非依赖性的。 2.1.3 GFP变体——热稳定荧光蛋白谱 人们在1998年构建了不稳定增强型绿色荧光蛋白（dEGFP）。原理就是将EGFP的cDNA融合到小鼠鸟氨酸脱羧酶（Ornithine decarboxylase, ODC）基因的C-末端。ODC含有一个PEST序列，这个序列可促进该蛋白在细胞内的降解。虽然，目前这些不稳定变体还没有在小鼠中应用，但这些变体有利于实时追踪基因表达动力学的研究。 2.1.4 GFP为基础的报告系统在基因打靶和转基因中的应用 许多实验室应用ES细胞作为转基因工具来检验wtGFP变体。 2.1.5 表达荧光蛋白小鼠的新应用——荧光激活细胞分选（FACS） GFP作为报告系统在基因打靶和转基因小鼠中的应用，引发了一些新的很有应用前景的方法的建立和应用。从复杂的组织中获得感兴趣的细胞类型对现代生物学的许多领域都是有益的。 2.1.6 表达多种荧光蛋白的小鼠的新应用——应用多种无创的报告基因的可行性 目前，人们已经建立了多种仅用一种荧光蛋白标记的ES细胞，如ECFP、EGFP、EYFP，并且用它们生产了表达不同GFP变体报告基因的小鼠品系。最近，研究人员在转基因小鼠研究中混合使用多种荧光蛋白作为报告基因，证明了不同的荧光蛋白变体可在神经元中选择性表达，从而获得了表达两种不同荧光蛋白的转基因小鼠，并且能够在同一动物体内比较不同的神经元亚群。 2.2 我国科学家2007年获得体细胞核移植生产绿色荧光蛋白转基因猪 2007年，我国东北农业大学的科学家利用体细胞核移植技术成功构建出绿色荧光蛋白转基因猪。他们用脂质体转染猪胎儿成纤维细胞，筛选绿色荧光蛋白基因转染的阳性细胞作为体细胞核移植的核供体，体外成熟卵母细胞为核受体，从而获得绿色荧光蛋白转基因克隆猪胚胎。他们共获得6头克隆猪，其中4头为GFP阳性，经DNA检测确认为GFP转基因猪。 该研究对我国体细胞克隆转基因猪的研究具有重要价值，为转基因猪育种、人类疾病模型和人类器官移植研究奠定了良好的基础。 3. GFP在肿瘤研究中的应用 目前，研究人员已经建立了应用GFP在活体内检测细胞并使之可视化的方法，从而能够在显微水平检测新鲜活组织中的肿瘤细胞。在此基础上建立的利用GFP进行全身成像技术更是在肿瘤研究中得到广泛应用。该技术能够实时观察活体小鼠体内荧光标记肿瘤的生长和转移并实时成像。GFP全身成像技术在动物体外操作，对动物无创。该技术能够让研究人员连续监测肿瘤在完整动物体内的恶性生长和转移的情况，无需注射任何底物也无需麻醉。另外，还可以通过数字化的全身成像来定量测定内脏肿瘤的生长，既可通过透射倒置荧光显微镜成像，也可用荧光盒和热电冷却的颜色电荷耦合器摄像头来成像。 三、 荧光蛋白技术的最新研究进展 1. 新增荧光蛋白 人们进一步研究荧光蛋白发色团的复杂特性，找到了关于多肽骨架结构与功能关系的线索，因此借助基因工程更精细的调整颜色变体，并扩大有用蛋白的光谱范围就变得更加容易了。 2. 各种荧光蛋白的最新研究进展 2.1 蓝色和蓝绿色荧光蛋白 目前，虽然大多数研究人员把注意力集中于橙色到远红外光谱区域，但最近BFP和CFP变体在成像中的应用潜力出人意料地受到研究人员的关注。虽然EBFP是Aequorea GFP来源的最早的光谱变体之一，但其亮度低、光稳定性差，使其很久以来没有引起多数研究者的注意。 蓝绿光谱区域（约470nm~500nm）一直是原始的Aequorea ECFP（表6）衍生物占优势，直到一个单体的水鸭色（又称水鸭蓝，是蓝色与绿色正中的颜色）变体mTFP1（图22c）出现。这种荧光蛋白亮度更强，具有酸不敏感性，而且光稳定性更强。来源于四聚体软珊瑚蛋白的mTFP1光谱特性与大多数CFP相比，有稍微的红移，所以命名为水鸭色而不是蓝绿色。与其它CFP不同，mTFP1在发色团的第66位氨基酸是酪氨酸而不是通常的色氨酸。酪氨酸代替色氨酸，使得荧光激发光谱宽度从大约60nm降低到更容易操作的30nm，这样就降低了多色实验和FRET实验中的色度亮度干扰效应。虽然说mTFP1需要特殊的滤光片设备来成像，但是用标准的ECFP滤光片设备也能产生合适的信号水平。 最近，应用一种更好的点直接突变方法进行ECFP和EYFP单体变体的突变优化，以增强亮度、折叠效率、可溶性及FRET性能。这样就产生了超级蓝绿色和黄色荧光衍生物，它们分别被命名为SCFP和SYFP。在细菌中表达的这两种荧光蛋白明显要比原荧光蛋白亮度更强，但在哺乳动物细胞中表达的亮度却比原荧光蛋白弱两倍。不过，这些高性能的荧光蛋白应该有利于融合标签，能够用来创造新的更先进的且具有更大动态范围的CFP-YFP FRET生物传感器，用来检测代谢、pH变化、Ca2+波动、蛋白质和酶磷酸化及其它细胞内的生物活动。 2.2 绿色荧光蛋白 在光谱的绿光区（500nm-525nm）已经发现了多种荧光蛋白，而且来源广泛，包括不同种属的Aequorea、桡足类动物、文昌鱼以及珊瑚。 2.3 黄色荧光蛋白 作为一种光谱型，黄色荧光蛋白已经被开发成亮度最亮及最通用的遗传编码探针。 2.4 橙色荧光蛋白 与数以百计的蓝绿色、绿色及黄色光谱型荧光蛋白相比，在橙色和红色波长（约560nm到650nm）光谱区仅仅开发了几种探针。尽管如此，现有的这几种光谱型的蛋白（图21，表6）都是从珊瑚中分离得到的，并且在多种成像情景中显现出应用潜力，但在对橙色区域荧光蛋白的命名中存在混乱。通常被命名为红色荧光蛋白RFP的探针如DsRed、TagRFP及tdTomato，实际上具有明显的橙色多于红色的发射谱。不考虑颜色的指示，用标准的四甲基罗丹明异硫氰酸脂（tetramethyl-rhodamine isothiocyanate, TRITC）滤光片设备，橙色光谱型的蛋白在多种颜色，如蓝绿色、绿色和红色情景中更易于成像。 2.5 红色荧光蛋白 在活细胞及动物全身成像中需要表现较好的红色荧光蛋白，主要是由于在多种颜色成像实验中需要红色探针，另外基于较长的激发波长产生的光毒性较小，可以用来探测较深的生物组织。 研究人员借助一种新技术迭代体细胞超突变（somatic hypermutation, SMH），获得了两种新的荧光蛋白，这表明首次获得了真正的远红外基因工程探针（发射波长为625nm及649nm）。 2.6 光学加亮荧光蛋白 人们在对荧光蛋白变体复杂的光物理学特性的研究，找到了可被两种方式激活的发色团，它们可从静息态发射荧光（即光激活）或者发生荧光发射带宽的转变（即光转化）。这些蛋白出现后被作为一种新型的探针，在活细胞成像中及对蛋白质动力学的研究中最为理想。 来源于Pectiniidae（一种石化珊瑚虫）的单体荧光蛋白Dronpa的产生，宣告了新一代专门的开-关可控的可逆光学加亮荧光蛋白的产生。目前，人们已经从Anemonia sulcata分离到一种非荧光色素蛋白，开发出另一种光可控加亮荧光蛋白Kindling荧光蛋白（商品名KFP1）。KFP1只有在525nm和580nm间的绿色或黄色光照射下才发出荧光。低亮度的光导致瞬时红色荧光，其最大激发和发射谱分别为580nm和600nm，随着照射的停止而慢慢地衰退，重新恢复到原来非荧光状态。用强烈的蓝光（450-490nm）照射，会立即完全地淬灭红色荧光，这使得荧光标记受到很好的控制。相反，高强度的绿光（约550nm）照射或以中等水平持续照射，结果导致不可逆的光转换，产生强度比非活化蛋白强30倍的荧光。KFP1主要的缺点是其强制性的四聚体，这严重地影响其作为融合标签及其FRET中的应用。 2.7 越来越多的荧光蛋白发生斯托克斯位移 除了采用工程设计来调整发射谱外，荧光蛋白突变技术也靶向吸收峰与发射峰间的分离，即斯托克斯位移，来产生更好的探针以用于FRET、FCCS及多色成像。将wtGFP的第203位氨基酸由T苏氨酸突变为异亮氨酸I而产生的变体Sapphire在475nm就没有次激发峰。Sapphire表现出引人注目的112nm的斯托克斯位移，其激发峰和发射峰分别为399nm和511nm。在此基础上再进行四个额外的突变产生的衍生物T-Sapphire，其折叠功能得以改进并产生更亮的荧光。由于这些变体在紫外区能够被激发，在FRET中可作为极好的供体与橙色和红色蛋白一起应用。 3. 荧光蛋白工程进展 所有的荧光蛋白都是相似的三维圆柱形结构，多肽骨架的大部分折叠成11条氢键链接的β折叠片，中央为包含发色团的α螺旋，短的螺旋片段保护着圆柱的两端。这些β折叠片由不太有序排列的富含脯氨酸的环链接在一起，每个折叠片的氨基酸支链或者凹入蛋白质内部或者凸向表面。与多数可溶性蛋白相似，蛋白表面的残基常常带有电荷或极性，也包含部分疏水残基。该蛋白内部折叠很紧密，即使水分子也被疏水键固定在氨基酸上，而且离子或其它小分子的扩散空间极小。 钱永健等发明了一种真正独特的方法进行基因工程改造荧光蛋白，包括采用从免疫系统借鉴来的技术迭代体细胞超突变（somatic hypermutation, SHM）来直接优化。他们要产生发射波长在远红外区（>625nm）的红色荧光蛋白变体。 采用以上描述的方法对已有的蛋白进行微调，来改进它们的折叠特性、亮度、齐聚效应及光稳定性，毫无疑问最终能够得到比简单地从海洋中寻找到的荧光蛋白更好的探针。最近，荧光蛋白工程技术的突破已经得到了几种新的变体，这些都是传统方法无法做到的。这些技术已经用来产生新的颜色的荧光蛋白、建立更稳定的结构、增强折叠效率及优化FRET效率。或许新的方法将能够使得pH敏感性及光稳定性得到改善，这两点对其在酸性的细胞器官及长期成像实验中的应用是至关重要的。已知许多氨基酸三联体能使发射颜色发生巨大变化（如MYG，177nm；QYG，137nm；TYG，91nm；CYG，80nm），这表明在荧光蛋白序列中有足够的空间添加额外的突变，从而能够优化颜色及多种其它荧光蛋白的性质。 |
5楼2009-08-07 15:05:08
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