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WB常见问题分析 蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB )是很常规的生物学实验，是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 嗯，听起来不错，不过真正在实验室里做实验的小伙伴恐怕都遇到过各种实验结果不完美的状况，做了很久的WB，走了很多弯路，但是WB想要做好并不难，总结WB实验中可能会遇到的问题，分析可能的原因及对应的解决方案，这就是实验成功的基石。下面我们列举一些常见问题一个个分析。 1．胶片是一片空白，是怎么回事？ 答：如果能够排除下面的几个问题那么问题多半出现在一抗和抗原制备上。 1）二抗的HRP 活性太强，将底物消耗光； 2）ECL底物中H2O2不稳定，失活； 3）ECL底物没覆盖到相应位置； 4）一抗选择不当； 5） 二抗失活。 2．背景高咋回事？ 答：可能的原因有： • 1）膜没有完全均匀湿透,建议 使用100% methanol浸透膜； • 2）洗膜不充分，可以增加洗液体积和洗涤次数； • 3）电极不平衡或者加样位置偏斜，可以调整电极和加样； • 4）封闭物用量不足，可以提高封闭物浓度，孵育时保证封闭液完全浸没转印膜； • 5）封闭物使用不当，比如检测生物素标记的蛋白时不可用脱脂奶粉封闭； • 6）封闭时间不够，一般情况下室温37度封闭1小时以上或者4度封闭过夜； 7）抗体非特异性结合，可以降低抗体浓度，减少孵育时间 8）一抗稀释度不适宜，可以对抗体进行滴度测试，选择最适宜的抗体稀释度 9）一抗孵育的温度偏高，建议4℃结合过夜 10）抗体浓度过高或洗涤不够，建议降低抗体浓度，增加洗涤次数和时间 11）化学显色底物过多，建议按说明书加入适量的显色底物 3.为啥条带形状不好看？ 答：可能的原因有： 1）胶凝的不均匀或聚合不好，建议灌胶前将溶液充分混匀 2）某些样品盐浓度较高，建议除盐或将样品盐浓度调成一致 3) 缓冲液陈旧，成分改变,可以重配 4) 凝胶下面有气泡,电泳前要先将气泡赶走 5）电泳时温度过高，可以降低电流或电压 6）样品中含有不溶性颗粒，建议样品充分搅拌混匀 4．蛋白条带位置（大小）不对咋整？ 答：可能的原因有： • 胶浓度不对，不同浓度的胶跑出的蛋白条带的位置可能有所偏差，可以调整浓度 • 抗体孵育不充分,建议增加抗体浓度，延长孵育时间 3）酶失活，建议直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物 4）目的蛋白存在翻译后修饰或剪切体，建议查询相关文献确定 5）标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低，建议设置阳性对照比对结果，增加标本上样量 5．有很多杂带咋回事？ 答：可能的原因有： 1）目的蛋白有多个修饰位点，本身可以呈现多条带，建议查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白实际大小 2) 样本处理过程中目的蛋白发生降解,建议加入蛋白酶抑制剂；样本处理时在冰上操作 3）杂蛋白多，建议处理目的蛋白 4）抗体特异性不强，建议使用特异性强的抗体 5）抗体孵育时间过久，建议减少抗体孵育时间 6）二抗与抗原有交叉反应，建议选择合适的封闭物 7）二聚体或多聚体存在，建议增加蛋白质变性过程及强度 8）底物显色与曝光时间过长，建议缩短显色及曝光的时间 6．背景有黑色斑点或不均匀的白色斑点和暗背景上白色带 答：可能的原因有： • 1）抗体与封闭试剂反应，建议使用前过滤封闭试剂 2）HRP含量过高，建议降低酶联二抗的浓 3）HRP偶联二抗中有聚集体，建议过滤二抗试剂，去除聚集体 4）抗体分布不均匀，建议孵育抗体时使用摇床 7．细胞水平要做WB，多少细胞提的蛋白够做WB？ 答：一般5×10^6就足够。 8．为什么我的细胞提取液中没有检测到目的蛋白？ 答：可能的原因有： 1）细胞中不表达这种蛋白质，换一种细胞； 2）抗体不能识别目标蛋白，多看看说明，是否有问题； 3）可能是没有保持低温操作，样品保存不当，样品放置时间过长； 4）细胞中的蛋白质被酶降解掉了，可加入蛋白酶抑制剂，抑制蛋白酶活性。 9．我的目的带很弱，如何加强？ 答：1）可以加大抗原上样量，这是最主要的； 2）也可以将一抗稀释比例降低； 3）还可以延长曝光时间。 10．我做的蛋白质分子量很小(10KD)，怎么做WB? 答：1）可选择孔径0.22um的PVDF膜或者NC膜，转膜时间缩短，另外可采用Tricine-SDS-PAGE体系； 2）也可以选择PSQ 膜，同时缩短转移时间。也可以将两张膜叠在一起，再转移。其他按步骤即可。 11．大分子量蛋白200KD，在做WB要注意什么？ 答：1）做200kd蛋白的WB时要注意，分离胶最好选择>7%的；剥胶时要小心； 2）转移时间需要相应延长；要做分子量参照（否则出现杂带不知道如何分析）； 3）转膜液中甲醇含量可适当降低，推荐使用湿装转膜效率更高哦! 12．如果上样量超载，要用什么方法来增加上样量？ 答：可以浓缩样品，也可以根据目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超载30％是不会有问题的。如果已经超了不少了，而且小分子量的也要，可以考虑加大胶的厚度，可以试试1.5mm的。 13．WB中抗体的可以重复应用吗？ 答：抗体工作溶液一般不主张储存反复使用，但是如抗体比较珍贵，可反复使用2－3次。稀释后应在2－3天内使用，4度保存，避免反复冻融。 14．上下槽缓冲液有何要求，怎样能达到最佳效果？ 答：无特殊要求。但一般是上槽放新鲜的缓冲液，下槽可以是重复使用过一两次的缓冲液。 15．免疫组化和WB可以用同一种抗体吗？ 答：免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇（又称表位），有些表位是线性的，而有的属于构象型；线性表位不受蛋白变性的影响，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；构象型表位由于受蛋白空间结构限制，煮后变性会消失。如果所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸，也就是线性表位，那么这种抗体可同时用于免疫组化和WB，而如果抗体识别构象形表位，则只能用于免疫组化。 |
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