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小汰宝

金虫 (正式写手)

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[求助] BAC文库做表达转化，一开始能检测到产物，但是越来越少，最后重复不出来

从师姐手里拿到一份当时他们构建的BAC文库，是一个土壤环境里的宏基因组打断了以后每个BAC连了约200kb的片段，导进了大肠杆菌，甘油菌形式存在96孔板里。

我们把孔板里的菌接到平板培养，培养结束后抠点平板上的菌泥进96孔板做反应，用显色法检测目标产物。

第一次做的时候，在2000多株菌的文库里出现了40度株可以显色的菌，其中有两株经过复筛已经在液相上验证出有目标产物峰。

想重复一下，结果无论是从原始孔板开始做，还是从我们接的平板上的菌开始做，重复完了都显色很淡，再重复一次，就检测不到显色了，液相更是检测不到产物了。

我们以为是把菌反复从-80℃里拿出来造成了冻融裂解，就去问师姐要了当时他们备份的菌库

结果又出现这个情况：第一次做的时候出现了显色，再而衰三而竭...

想知道这是什么问题，因为质粒比较大，现在也不敢贸然提质粒去测序，但是一直重复不出来，不知道该怎么进行下去

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