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phoebecheung

金虫 (小有名气)

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[交流] 有谁做过半胱氨酸蛋白酶(caspase)活性检测的？急呀！

有谁做过半胱氨酸蛋白酶(caspase)活性检测的，要用到些什么仪器，有什么试剂盒之类的吗，帮帮忙，谢谢！

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1楼 2009-03-05 15:01:09

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

用荧光定量法测定caspase的活性：
收集三组实验组细胞，离心(12,000 rpm，5 min)，弃上清，冰冷PBS洗涤两次，收集细胞沉淀。
在各组细胞沉淀中加入70 µL冰冷的细胞裂解缓冲液，重悬细胞，置4℃裂解30 min。
在4℃下，离心(12,000 rpm，20 min)以沉淀细胞碎片，收集上清液(即为细胞裂解液)。
以牛血清白蛋白作为标准，用BCA法测定蛋白浓度,然后用Biophotometer测定蛋白质含量，确定每种细胞裂解物样品中蛋白质的含量。
Caspase消化反应体系为：反应总体积250 µL，包括50 µg细胞裂解液、3µL 人工合成的caspase特异底物Ac-DEVD-AFC以及50 µL 反应缓冲液，加无菌双蒸水补足250 µL。充分混匀后，37℃反应1 h。
反应完毕后向反应体系加入1mL反应缓冲液以冲淡其反应，接着置于荧光分光光度计上检测caspase的活性。测定所用激发波长(Ex)为400 nm，发射波长(Em)为505 nm。

我以前论文做过的……

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