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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 综合其他 » PCR扩增的片段，可以不经酶切直接作为目的基因与载体进行连接么？
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Korea??

新虫 (正式写手)

[交流] PCR扩增的片段，可以不经酶切直接作为目的基因与载体进行连接么？ 已有3人参与

扩增的片段一般为平端，连接率很低吧？

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1楼 2018-01-13 11:27:48
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快叫爸爸666

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
肯定要酶切啊，不然不互补，你让它怎么连接

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2楼2018-01-13 12:21:14
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drwhoknowss

荣誉版主 (正式写手)
可以啊，平端对平端就可以了。不过你要跑胶纯化一下，否则连上的都是引物二聚体
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Progress in science depends on new techniques, new discoveries and new ideas, probably in that order. -- Nobel laureate Sydney Brenner
3楼2018-01-13 12:59:44
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Korea??

新虫 (正式写手)
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3楼: Originally posted by drwhoknowss at 2018-01-13 12:59:44
可以啊，平端对平端就可以了。不过你要跑胶纯化一下，否则连上的都是引物二聚体

这样啊，难怪我链接、酶切后都得不到复合我预计大小的基因。谢谢

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4楼2018-01-13 19:42:43
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Korea??

新虫 (正式写手)
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2楼: Originally posted by 快叫爸爸666 at 2018-01-13 12:21:14
肯定要酶切啊，不然不互补，你让它怎么连接

我和你的想法是一样的，但是实验室的前辈让这么干，我想她们是不是已经设计好了。但是得出来的结果一点不符合预期。

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5楼2018-01-13 19:45:31
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Korea??

新虫 (正式写手)
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3楼: Originally posted by drwhoknowss at 2018-01-13 12:59:44
可以啊，平端对平端就可以了。不过你要跑胶纯化一下，否则连上的都是引物二聚体

我的载体酶切后，和PCR扩增产物一起跑胶提纯了，也就是说我的载体也应该是被平切了吧？但是连接效果不理想啊，应该引物二聚体很多。

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6楼2018-01-13 19:50:52
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drwhoknowss

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6楼: Originally posted by Korea?? at 2018-01-13 19:50:52
我的载体酶切后，和PCR扩增产物一起跑胶提纯了，也就是说我的载体也应该是被平切了吧？但是连接效果不理想啊，应该引物二聚体很多。

...

要保证你切质粒用的酶能产生平端。还有要用高保真酶，普通taq酶会自动加一个A，不是完美平端。
最后这种平端对平端，不能保证方向。所以50% 的可能DNA在质粒上是反的，不过有时候不重要，看具体情况。
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7楼2018-01-13 21:55:50
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Korea??

新虫 (正式写手)
还有这么多问题哦

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8楼2018-01-14 08:14:12
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drwhoknowss

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8楼: Originally posted by Korea?? at 2018-01-14 08:14:12
还有这么多问题哦

欢迎进入分子深坑
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Progress in science depends on new techniques, new discoveries and new ideas, probably in that order. -- Nobel laureate Sydney Brenner
9楼2018-01-14 12:12:29
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FIXU

新虫 (初入文坛)
自连也不可避免
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10楼2018-01-15 10:18:45
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