| 查看: 280 | 回复: 4 | |||
| 当前主题已经存档。 | |||
baobeiding金虫 (小有名气)
|
[交流]
金葡菌中质粒的提取~！~！
|
||
|
将构建好的质粒电转化到金黄色葡萄球菌中，电转化后在双抗性平板上长了一个单菌落，并且在双抗性培养基中都能生长！ 但是我遇到了一个大难题，就是怎么将电转化进去的质粒提取出来，酶切鉴定！！请高人不吝赐教！~！小女子感激不尽~！~！ 急切的盼望您的帮助~！~！Sample TextSample Text |
回复此楼» 猜你喜欢
0817 化学工程 299分求调剂 有科研经历 有二区文章
已经有17人回复
-
一志愿武汉理工材料工程专硕调剂
已经有5人回复
-
0856调剂，是学校就去
已经有7人回复
-
申博26年
已经有3人回复
-
一志愿吉林大学材料学硕321求调剂
已经有10人回复
-
0703化学调剂 ，六级已过，有科研经历
已经有12人回复
-
294求调剂材料与化工专硕
已经有13人回复
-
288求调剂
已经有14人回复
-
307求调剂
已经有8人回复
-
一志愿南京理工大学085701资源与环境302分求调剂
已经有5人回复
heshuilian
金虫 (正式写手)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 1343.2
- 散金: 273
- 红花: 1
- 帖子: 423
- 在线: 74.4小时
- 虫号: 644245
- 注册: 2008-11-03
- 专业: 植物进化生物学
★ ★ ★ ★
baobeiding(金币+4,VIP+0):很详细，，谢谢1 4-9 09:54
baobeiding(金币+4,VIP+0):很详细，，谢谢1 4-9 09:54
|
从细菌中分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤:培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞;分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可以破坏菌体细胞壁,十二烷基磺酸钠(SDS)和Triton X-100可使细胞膜裂解。经溶菌酶和SDS或Triton X-100处理后,细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上,同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多,易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。当用强热或酸、碱处理时,细菌的线性染色体DNA变性,而共价闭合环状DNA(Covalently closed circular DNA,简称cccDNA)的两条链不会相互分开,当外界条件恢复正常时,线状染色体DNA片段难以复性,而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起,而质粒DNA双链又恢复原状,重新形成天然的超螺旋分子,并以溶解状态存在于液相中。 在细菌细胞内,共价闭环质粒以超螺旋形式存在。在提取质粒过程中,除了超螺旋DNA外,还会产生其它形式的质粒DNA。如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂,分子就能旋转而消除链的张力,形成松驰型的环状分子,称开环DNA(Open circular DNA, 简称 ocDNA)；如果质粒DNA的两条链在同一处断裂,则形成线状DNA(Linear DNA)。当提取的质粒DNA电泳时,同一质粒DNA其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快。 |
2楼2009-03-03 21:14:45
heshuilian
金虫 (正式写手)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 1343.2
- 散金: 273
- 红花: 1
- 帖子: 423
- 在线: 74.4小时
- 虫号: 644245
- 注册: 2008-11-03
- 专业: 植物进化生物学
|
一、 小量酶解反应 （一）主要用于质粒的酶切鉴定。 典型的酶切反应体系如下： 质粒DNA 10μl10×缓冲液 2μl 限制酶 1μl 双蒸去离子水 7μl 总体积 20μl （二）操作方法按下列顺序加入试剂： 在灭菌的新的Ep管中加入7μl双蒸水 ↓ 加入10×缓冲液2μl ↓ 加入质粒DNA样本10μl ↓ 最后加限制酶1μl（操作应迅速，用后立即放回低温冰箱） ↓ 稍离心，混合 ↓ 置37℃水浴1～1.5小时（须将管盖盖严，避免水蒸气进入管内） ↓ 取出后，电泳分析鉴定是否酶解。 二、 大量酶解反应主要用于大剂量制备基因片段。 一般反应体积在50～100μl，DNA用量在10～30μg，如设计100μl的反应体系，在新的Ep管中依次加入下列试剂： 10×缓冲液 10μl限制酶 2μl（20u） 质粒DNA样本 15μl最后加入双蒸水，补足反应总体积100μl ↓ 置37℃水浴1～1.5小时 ↓ 取5μl电泳鉴定酶解效果。（如酶解不完全，可继续水浴，或加适量限制酶。） |
3楼2009-03-03 21:16:09
120101405
铁杆木虫 (正式写手)
- 博学EPI: 1
- 应助: 2 (幼儿园)
- 金币: 5339.5
- 红花: 2
- 帖子: 619
- 在线: 60.7小时
- 虫号: 632774
- 注册: 2008-10-21
- 专业: 环境工程
4楼2009-03-03 21:27:38
j2
木虫 (正式写手)
- 博学EPI: 2
- 应助: 56 (初中生)
- 金币: 3797.8
- 散金: 2
- 红花: 4
- 帖子: 688
- 在线: 108.8小时
- 虫号: 452275
- 注册: 2007-11-05
- 性别: MM
- 专业: 卫生检验
5楼2009-03-04 10:04:53
