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baobeiding

金虫 (小有名气)

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[交流] 金葡菌中质粒的提取~！~！

将构建好的质粒电转化到金黄色葡萄球菌中，电转化后在双抗性平板上长了一个单菌落，并且在双抗性培养基中都能生长！
但是我遇到了一个大难题，就是怎么将电转化进去的质粒提取出来，酶切鉴定！！请高人不吝赐教！~！小女子感激不尽~！~！
急切的盼望您的帮助~！~！Sample TextSample Text

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1楼 2009-03-03 16:49:59

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heshuilian

金虫 (正式写手)

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★ ★ ★ ★
baobeiding(金币+4,VIP+0):很详细，，谢谢1 4-9 09:54

从细菌中分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤:培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞;分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可以破坏菌体细胞壁,十二烷基磺酸钠(SDS)和Triton X-100可使细胞膜裂解。经溶菌酶和SDS或Triton X-100处理后,细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上,同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多,易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。当用强热或酸、碱处理时,细菌的线性染色体DNA变性,而共价闭合环状DNA(Covalently closed circular DNA,简称cccDNA)的两条链不会相互分开,当外界条件恢复正常时,线状染色体DNA片段难以复性,而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起,而质粒DNA双链又恢复原状,重新形成天然的超螺旋分子,并以溶解状态存在于液相中。

在细菌细胞内,共价闭环质粒以超螺旋形式存在。在提取质粒过程中,除了超螺旋DNA外,还会产生其它形式的质粒DNA。如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂,分子就能旋转而消除链的张力,形成松驰型的环状分子,称开环DNA(Open circular DNA, 简称 ocDNA)；如果质粒DNA的两条链在同一处断裂,则形成线状DNA(Linear DNA)。当提取的质粒DNA电泳时,同一质粒DNA其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快。

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2楼2009-03-03 21:14:45

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heshuilian

金虫 (正式写手)

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一、小量酶解反应
（一）主要用于质粒的酶切鉴定。
典型的酶切反应体系如下：
质粒DNA 10μl10×缓冲液 2μl
限制酶 1μl
双蒸去离子水 7μl
总体积 20μl
（二）操作方法按下列顺序加入试剂：
在灭菌的新的Ep管中加入7μl双蒸水
↓
加入10×缓冲液2μl
↓
加入质粒DNA样本10μl
↓
最后加限制酶1μl（操作应迅速，用后立即放回低温冰箱）
↓
稍离心，混合
↓
置37℃水浴1～1.5小时（须将管盖盖严，避免水蒸气进入管内）
↓
取出后，电泳分析鉴定是否酶解。
二、大量酶解反应主要用于大剂量制备基因片段。
一般反应体积在50～100μl，DNA用量在10～30μg，如设计100μl的反应体系，在新的Ep管中依次加入下列试剂：
10×缓冲液 10μl限制酶 2μl（20u）
质粒DNA样本 15μl最后加入双蒸水，补足反应总体积100μl
↓
置37℃水浴1～1.5小时
↓
取5μl电泳鉴定酶解效果。（如酶解不完全，可继续水浴，或加适量限制酶。）

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3楼2009-03-03 21:16:09

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